龍葵生物堿自微乳化制劑配方研究

張 威，賈曉斌，劉美輝，朱勁華*

1江蘇建康職業(yè)學(xué)院，南京 210029;2 江蘇省中醫(yī)藥研究院，南京 210028

龍葵(Solanum nigrum)別名苦葵、天茄子、老鴉眼睛草、水茄、天泡果、天泡草、老鴉酸漿草、山海椒等［1］，主要用于抗癌。李時(shí)珍著《本草綱目》記載:其味苦，微甘，寒，滑，無(wú)毒。主治癰疽腫毒，跌打損傷，功能消腫散血，通利小便。臨床上廣泛運(yùn)用龍葵水煎劑或注射劑治療宮頸癌、食道癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、絨毛膜上皮癌、卵巢癌、肉瘤等多種惡性腫瘤［2］，因而龍葵也被中醫(yī)學(xué)列為十大抗腫瘤中草藥之一。近年來(lái)，龍葵的抗癌作用受到廣泛關(guān)注，對(duì)其抗癌有效成分進(jìn)行大量的研究證明，其抗腫瘤的主要成分為生物堿［3-6］;如賈艷菊等［5］用MTT 法觀察龍葵生物堿的體外抗腫瘤作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)100～800 μg/mL 的龍葵生物堿對(duì)HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制作用。李明慧等［7］觀察龍葵甾體類(lèi)生物堿對(duì)荷瘤(S180)小鼠及對(duì)Lewis 肺癌移植瘤小鼠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)龍葵甾體類(lèi)生物堿不僅具有抑制腫瘤增長(zhǎng)的作用，還可顯著提高荷瘤小鼠血清TNFa、IL-2、IL-6、IL8 的水平。李志雄等［8］研究龍葵堿對(duì)前列腺癌LNCaP 及Du145 細(xì)胞系的抑制作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)龍葵堿可以通過(guò)線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡的發(fā)生，能將腫瘤細(xì)胞周期阻滯在S 期，由此產(chǎn)生抑制增殖作用。龍葵生物堿因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)而難溶于水，可選擇自微乳給藥系統(tǒng)［9］(Self-microe mulsifying Drug Delivery System，SMEDDS)作為龍葵生物堿的給藥載體，以提高其生物利用度，促進(jìn)藥物的吸收。自乳化藥物傳遞系統(tǒng)是由油相、非離子表面活性劑和助表面活性劑組成的固體或液體制劑，其基本特征是可在胃腸道內(nèi)或環(huán)境溫度適宜(通常指體溫37 ℃)及溫和攪拌的條件下，自發(fā)乳化形成粒徑在100～500 nm 左右的乳劑。而當(dāng)親水性表面活性劑(HLB ＞12)含量較高(≥40%，W/W)或同時(shí)使用助乳化劑時(shí)，在輕微攪動(dòng)下可制得更精細(xì)的乳劑(粒徑50 nm 左右)，則被稱(chēng)為自微乳化藥物傳遞系統(tǒng)［10］。目前最常用自乳化藥物傳遞系統(tǒng)的乳化劑有乙氧基聚氧乙烯甘油酯、聚氧乙烯油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚及吐溫等;常用的助乳化劑多為中、短鏈的一元或二元醇，如乙醇、丙二醇等;常用的油相有蓖麻油、豆油、花生油、橄欖油、肉豆蔻酸異丙酯、脂肪酸三酰甘油等［11］。本文選用常見(jiàn)的乳化劑、助乳劑及油相作為龍葵生物堿的自微乳制劑配方，對(duì)各因素進(jìn)行研究，以找到龍葵生物堿自微乳制劑的最佳配方［12］，為進(jìn)一步通過(guò)自乳化藥物傳遞系統(tǒng)給藥的藥效研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器和試藥

85-2 型恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司);AL204 型梅特勒-托利多十萬(wàn)分之一分析天平和百萬(wàn)分之一天平(上海亞津電子科技有限公司);JJ-800 型精密電子天平(美國(guó)雙杰儀器公司);H.H.S 數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海錦凱科學(xué)儀器有限公司);3000HSA 型激光粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);島津UV-2450/2550 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津公司)。

吐溫-20(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，聚氧乙烯辛基苯基醚(OP 乳化劑，上海玖意化學(xué)試劑有限公司)，油酸(上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司)，1，2-丙二醇(PPD，上海譜振生物科技有限公司)，龍葵總生物堿提取物(自提，批號(hào):20120302)，注射用水(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法與結(jié)果

微乳的粒徑是SMEDDS 質(zhì)量控制和處方篩選的重要指標(biāo)，也是區(qū)分乳劑、亞微乳、微乳的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)微乳的制備是按照下列各表固定處方中表面活性劑、助表面活性劑、油相中的用量，將表面活性劑、助表面活性劑、油相混合均勻，然后加入龍葵甾體生物總堿，充分?jǐn)嚢枋固崛∥锶芙馔耆?，得到棕紅色SMEDDS 濃縮液，經(jīng)稀釋后通過(guò)馬爾文粒度儀測(cè)定其粒徑。又因?yàn)橥腹饴屎妥晕⑷榈牧接械木o密相關(guān)性，即對(duì)于粒徑足夠小且分散穩(wěn)定的微乳而言，透光率越高，乳滴的粒徑越小，自乳化效果也就越好。將所得SMEDDS 濃縮液，加水稀釋?zhuān)?00 nm 下測(cè)定透光率［13］。以各因素變化對(duì)粒徑和透光率的影響，觀察各因素對(duì)乳化效果的影響。

2.1 表面活性劑吐溫-20 的用量對(duì)透光率的影響［14］

按照表1 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分?jǐn)嚢枋股飰A提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測(cè)量其粒徑，并以透光率為指標(biāo)，在600 nm 處測(cè)定透光率的值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 吐溫-20 對(duì)粒徑和透光率的影響Table 1 Effect of Tween-20 on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，吐溫-20 的最佳用量在200～300 mg 之間。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雖然吐溫-20 用量為300 mg 時(shí)粒徑最小(25.3 nm)、透光率最高(81.3%)，較吐溫-20 用量為200 mg 時(shí)用量增加了50%，粒徑只減小3 nm，透光率只增加2%。為了便于篩選，綜合考慮吐溫-20 的用量及其對(duì)粒徑的影響，下面試驗(yàn)中吐溫-20 的用量均以200 mg 加入。

2.2 表面活性劑OP 乳化劑的用量對(duì)透光率的影響［15］

按照表2 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分?jǐn)嚢枋股飰A提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測(cè)量其粒徑，并以透光率為指標(biāo)，在600 nm 處測(cè)定透光率的值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 OP 乳化劑對(duì)粒徑和透光率的影響Table 2 Effect of polyoxyethylene octyl phenyl ether on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn)，OP 乳化劑的用量以200 mg 為最佳。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著OP 乳化劑使用量的增加，微乳的粒徑先減小后增大，整個(gè)體系透光率的變化是先增大后減小。當(dāng)OP 乳化劑的用量為200 mg 時(shí)，粒徑最小，透光率最大。為了便于篩選，下面試驗(yàn)中均以O(shè)P 乳化劑200 mg 的用量加入。

2.3 油酸的用量對(duì)微乳透光率的影響

按照表3 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分?jǐn)嚢枋股飰A提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測(cè)量其粒徑，并以透光率為指標(biāo)，在600 nm 處測(cè)定透光率的值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 油酸對(duì)粒徑和透光率的影響Table 3 Effect of oleic acid on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗(yàn)的結(jié)果可見(jiàn)，油酸用量以50 mg 較佳。根據(jù)“膨脹膠束理論”，油相的加入會(huì)將原來(lái)混合乳化劑的膠束溶液中的膠束基團(tuán)進(jìn)一步溶脹，導(dǎo)致乳滴粒徑的逐漸增大，從而使整個(gè)體系的透光率逐漸減小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著油相量的增加，微乳相應(yīng)的粒徑應(yīng)隨油相含量的增大而增加，其透光率大幅度減少。這與“膨脹膠束理論”所闡明的結(jié)果相一致。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入的油相在一定范圍(40～60 mg)之內(nèi)并沒(méi)有使整個(gè)體系的粒徑和透光率發(fā)生很大的變化，這可能和體系中使用了混合表面活性劑有關(guān)。因?yàn)榛旌媳砻婊钚詣┑拇嬖谑沟肙/W 型微乳的粒子表面的柔韌性以及抗水稀釋能力大大加強(qiáng)，所以在一定范圍內(nèi)，混合表面活性劑、助表面活性劑可以很好的控制油/水界面張力在一定范圍內(nèi)。

2.4 助表面活性劑1，2-丙二醇的用量對(duì)透光率的影響

按照表4 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物10 mg 加入，充分?jǐn)嚢枋股飰A提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測(cè)量其粒徑，并以透光率為指標(biāo)，在600 nm 處測(cè)定透光率的值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 1，2-丙二醇對(duì)粒徑和透光率的影響Table 4 Effect of 1，2-propanediol on particle size and transmittance of SMEDDS

本試驗(yàn)使用了1，2-丙二醇作為助表面活性劑，主要為了調(diào)節(jié)微乳體系的HLB 值。從試驗(yàn)結(jié)果看，隨著助表面活性劑用量的增加，整個(gè)體系粒徑開(kāi)始慢慢變小，透光率隨之增大，但達(dá)到一定階段之后，即使再增大助表面活性劑的用量也不能使其粒徑和透光率發(fā)生大的改變。從盡量減少微乳體系中表面活性劑、助表面活性劑的角度出發(fā)，1，2-丙二醇的加入量以500 mg 為佳。

2.5 龍葵總生物堿提取物的用量對(duì)微乳透光率的影響

按照表5 列出的量，將吐溫-20、OP 乳化劑、油酸、1，2-丙二醇混合，再將龍葵甾體總生物堿提取物以不同的量加入，充分?jǐn)嚢枋股飰A提取物溶解完全，得該處方自微乳濃縮液。精密取出1 mL 微乳濃縮液加入到10 mL 注射用水中，輕微震蕩后測(cè)量其粒徑，并以透光率為指標(biāo)，在600 nm 處測(cè)定透光率的值，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 龍葵總生物堿提取物的用量對(duì)粒徑和透光率的影響Table 5 Effect of amount of S.nigrum alkaloid on particle size and transmittance of SMEDDS

從試驗(yàn)結(jié)果看，當(dāng)體系載藥后，增個(gè)體系的粒徑不斷增大。當(dāng)龍葵甾體總生物堿提取物在5～15 mg 時(shí)，粒徑增大、透光率減小較緩，但當(dāng)龍葵甾體總生物堿提取物由15 mg 變成20 mg 時(shí)，粒徑幾乎增大了一倍，透光率減小了15%。綜合考慮載藥量和粒徑增大兩個(gè)方面的因素，選擇體系中的龍葵總生物堿提取物的加入量以10 mg 為佳。

3 結(jié)論

處方中乳化劑的用量越大，其微乳的毒性相應(yīng)也會(huì)增加，所以實(shí)驗(yàn)中在保證微乳自乳化效率的前提下，盡可能的降低乳化劑的含量。最終確定最佳處方為:吐溫-20 200 mg，OP 乳化劑200 mg，油酸40 mg，1，2-丙二醇500 mg，龍葵總生物堿提取物10 mg。此SMEDDS 配方為進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)等方式進(jìn)一步探索龍葵生物堿自微乳化制劑最佳配方奠定必要的基礎(chǔ)。

1 Chinese Materia Medica Editorial Committee of State Administration of Traditional Chinese Medicine(國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)).Chinese Materia Medica(中華本草).Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers，1999.7.

2 Gui XL(歸小龍).Effects of antitumor of alkaloids from Solanum nigrum.Chin J Inf Tradit Chin Med (中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志)，2009，S1(16):80-82.

3 Guo JH(顧錦華)，Zhang W(張偉)，Li F(李峰)，et al.The antineoplastic effect of Solanum nigrum compound capsule and its influence on tumor cell cycle.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2006，11:2463-2464.

4 Li J，Li QW，F(xiàn)eng T.Aqueous extract of Solanum nigrum inhibit growth of cervical carcinoma (U14)via modulating immune response of tumor bearing mice and inducing apoptosis of tumor cells.Fitoterapia，2008，2:548-556.

5 Jia YJ(賈艷菊)，Dai L(代玲)，Zhang C(張燦).Study on apoptosis of HeLa cells induced by solanine.Prog Veterin Med(動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展)，2010，31(8):51-54.

6 Ding X(丁霞)，Gao SG(高思國(guó))，Li GY(李冠業(yè)).Research of antitumor effects in vitro from Solanum nigrum different extract part.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2011，22:1244-1246.

7 Li MH(李明慧)，Sun SQ(孫世清)，Cao L(曹亮)，et al.Effects of steroid alkaloids from Solanum nigrum on S180and Lewis lung carcinoma bearing mice.Chin J Nat Med(中國(guó)天然藥物)，2008，6:223-226.

8 Li ZX(李志雄)，Liang WB(梁蔚波)，Tang H(唐暉)，et al.Effects of alkaloids from Solanum nigrum on prostatic carcinoma LNCaP and Du145.Guangdong Med J(廣東醫(yī)學(xué))，2013，34:1153-1156.

9 Li JH(李劍惠)，Hu Y(胡英)，Qin FH(欽富華).Preparation and quality evaluation of loratadine self-emulsilying drug delivery system.Central South Pharm (中南藥學(xué))，2008，6:414-416.

10 Li ZM(李兆明)，Chen Z(陳智)，Yu F(于峰)，et al.Development of self-microemulsifying drug delivery system.Qilu Pharm Aff(齊魯藥事)，2009，2:98-100.

11 Yuan HJ(袁海建)，Chen Y(陳彥)，Jia XB(賈曉斌).Research and application of traditional Chinese medicine SMEDDS.China J Tradit Chin Med Pharm(中華中醫(yī)藥雜志)，2008，6:524-527.

12 Han J(韓靜)，Cui SM(崔升淼).Design and in vitro evaluation of self-microemulsifying drug delivery system for puerarin.Central South Pharm (中南藥學(xué))，2009，10:731-734.

13 Zhang XN(張學(xué)農(nóng)).Antitumor Medicines-Research of Paclitaxel Microemulsion (抗腫瘤藥物——紫杉醇微乳的研究).Beijing:Peking University，2002.

14 Song J(宋潔)，Li YL(李永玲).Research of perilla-oil SMEDDS prescription.Chin J Conval Med (中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué))，2010，1(19):75-76.

15 Shen X (沈熊)，Wu W (吳偉).Self-emulsifying and self-emulsifying drug delivery system.Fudan Univ J Med Sci (復(fù)旦學(xué)報(bào)，醫(yī)學(xué)版)，2003，30:180-183.