大黃酚與甲基化-β-環(huán)糊精的超分子包合和體外釋放特性研究

吳 振，李 紅，陳 崗，師 萱，譚紅軍*

1重慶市中藥研究院，重慶 400065;2 重慶市食品藥品檢驗所，重慶 401121;3 重慶市計量質量檢測研究院 重慶市食品安全工程技術中心 國家農副加工產品及調味品質量監(jiān)督檢驗中心，重慶 401123

大黃酚(chrysophanol，Chr)，是大黃、虎杖、何首烏、決明子等中藥中提取的一種蒽醌類活性成分，化學名為1，8-二羥基-3-甲基蒽醌(圖1)，具有抗菌、縮短血液凝固時間、興奮神經、麻痹肌肉、止咳、利尿、抗癌作用。近年來研究表明，大黃酚能延緩衰老，能清除氧自由基，增強抗氧化能力和改善學習記憶障礙等作用［1］。但大黃酚具有味苦、對胃有刺激性，難溶于水、理化性質不穩(wěn)定，見光易氧化等不利因素［2］，因而沒有適宜的劑型供臨床應用。因此，提高該類小分子生物活性成分的溶解度(增溶)對其在醫(yī)藥中的廣泛使用和生物功能發(fā)揮具有非常重要的意義。

近年來發(fā)現(xiàn)，超分子包合技術是提高難溶性非極性分子藥物溶解性的有效途徑之一。超分子包合技術應用的包合材料主要集中在環(huán)糊精、冠醚、杯芳烴、多聚糖等［3］，其中經過選擇性修飾的環(huán)糊精——甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD)，水溶性好，在有機溶劑中也表現(xiàn)出良好的溶解性，因此成為提高藥物溶解性的方法之一［4］。為此本實驗采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物制劑，旨在提高其溶解度和穩(wěn)定性，掩蓋不良氣味，減少其對胃的刺激性，同時，對其包合過程的熱力學參數和體外釋放特性進行研究，為大黃酚的應用提供更好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃酚標準品(Chr，HPLC≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司);2，6-甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD，平均取代度10.12，山東濱州智源生物科技有限公司);其它化學試劑均為國產分析純;所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

高效液相色譜儀(日本Shimadzu 公司);PHS-3C 酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司);SD-1500實驗型噴霧干燥機(上海沃迪科技有限公司);R-124 旋轉蒸發(fā)儀(瑞典BUCHI 公司)。

1.2 方法

1.2.1 Chr-M-β-CD 包合物和物理混合物的制備

采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物，分別稱取規(guī)定量的Chr 與M-β-CD 置于燒杯中，加入50%乙醇使二者溶解，置于磁力加熱攪拌器上，在30 ℃下，固定轉速為800 rpm，攪拌2 h后，靜置。將溶液真空旋轉蒸發(fā)除去乙醇，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾以除去未被包合的大黃酚，將濾液進行噴霧干燥，得Chr-M-β-CD 包合物固體粉末。噴霧干燥的工藝參數:蠕動泵流速:1.2 mL/min，進口溫度80 ℃，噴霧流量300 mL/h。

物理混合物的制備方法:準確稱取適量Chr 和M-β-CD(摩爾比和使用量與超分子包合物一致)，置于研缽中混合研磨，干燥，避光保存，備用。

1.2.2 相溶解度的測定

相溶解度的測定參考文獻［5］的方法，精密稱取M-β-CD 用蒸餾水配成質量分數為5、10、20、50、100、150 mmol/L 的系列溶液，分別吸取5 mL 置具塞試管中，均加入過量的Chr 固體粉末，超聲10 min后，置于恒溫振蕩器(調整振蕩頻率為100 rpm)中分別在25、35 和45 ℃條件下，振蕩5 h。使溶解達到平衡后，靜置，取上清液用0.45 μm 的微孔濾膜過濾，濾液用高效液相法測定Chr 的峰面積，用標準曲線計算Chr 的濃度。以M-β-CD 濃度(mmol/L)為橫坐標，Chr 濃度(mmol/L)為縱坐標，繪制平衡相溶解度圖，并計算線性回歸方程及包合常數，通過相溶解度的研究，分析M-β-CD 對Chr 的增溶作用。

1.2.3 等摩爾連續(xù)遞變法測定包合摩爾比

采用等摩爾連續(xù)遞變法(即Job’s 方法)確定化學計量比［6］，在實驗條件下，將所研究的Chr 和Mβ-CD 配制成一系列濃度比，而其總濃度固定不變，M-β-CD 的摩爾分數從0.1 增大至0.9。在最大吸收波長254 nm，測試體系溶液的吸光度為A1，純Chr溶液的吸光度為A2，以吸光度變化(△A=A2-A1)對M-β-CD 的摩爾組分作圖(Job’s 圖)，根據圖中吸光度變化△A 最大處對應的M-β-CD 的摩爾組分，即可以計算出主體M-β-CD 與客體Chr 的包合比。

1.2.4 超分子包合常數和包合過程熱力學參數計算

分別對不同溫度的各相溶解度曲線的直線部分作線性回歸，求得回歸方程的斜率(SS)和截距(S0)，按Higuchi-Connors 公式［7］計算超分子包合常數(Kb，L/mol)。

式中，SS為斜率;S0為截距，即各溫度下Chr 在未添加M-β-CD 的水溶液中的溶解度。

根據范特霍夫方程lnKb=-△H0/RT+△S0/R，以lnKb對1/T 作線性回歸，直線的斜率即為-△H0/R，截距即為△S0/R，從而求得包合反應的焓變△H0及熵變△S0;根據公式△G0=△H0-T△S0，計算不同溫度下的包合反應的吉布斯自由能變化△G0。

1.2.5 Chr-M-β-CD 包合物的體外釋放特性研究

參考《中國藥典》2010 年版溶出度測定第一法并略作修改，測定所得體系的的體外釋藥特性。具體方法為:取900 mL 含0.5%十二烷基硫酸鈉的pH 6.8 磷酸鹽緩沖液置于溶出杯中，加熱，待其溫度恒定在(37 ±0.5)℃后，分別精密稱取Chr 原藥5 mg、Chr-M-β-CD 包合物(相當于原藥5 mg)、物理混合物(摩爾比和使用量與超分子包合物一致，相當于原藥5 mg)置溶出杯中，調節(jié)轉速為100 rpm，分別于5～200 min 取樣(同時補充等量同溫溶液介質)，樣品經0.45 μm 濾膜過濾，采用HPLC 測定，計算各采樣點時樣品中的藥物濃度和累積釋放率。同批樣品測定6 份，結果取平均值。

1.2.6 HPLC 測定Chr 含量及方法學研究

HPLC 條件:日本島津公司LC-20A 高效液相色譜儀，色譜柱為C18Hypersil BDS(250 mm × 4.6 mm)。檢測波長:254 nm;柱溫:30 ℃;流動相甲醇-0.1%磷酸(65∶35);流速1.2 mL/min，進樣量:20 μL，大黃酚的HPLC 色譜圖具體如圖1 所示。

標準曲線:精密稱取Chr 標準品1.13 mg，以甲醇為溶劑溶解后定容到10 mL，搖勻得113 μg/mL Chr 對照品溶液，備用。精密吸取Chr 對照品溶液2、10、20、100、200、400、1000 μL 至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使?jié)舛瘸蔀?.113、0.565、1.130、5.650、11.300、22.600、56.500 μg/mL 的一系列對照品溶液，進樣，測定。以質量濃度對峰面積做線性回歸。得回歸方程Y=89977X-4833.3，R2=0.9999，線性范圍為0.113～56.5 μg/mL。

圖1 大黃酚(Chr)的HPLC 色譜圖(內插圖為Chr 分子結構)Fig.1 HPLC chromatogram of chrysophanol (insert:molecular structure of chrysophanol)

精密度實驗:制備低、中、高濃度的Chr 溶液，HPLC 測定，同日內測5 次及每天測1 次、連續(xù)測5 d。結果日內和日間的平均RSD 均＜2%，表明本方法精密度好。

重復性實驗:取Chr 對照品適量，共6 份，按樣品處理和測定方法平行測定，計算Chr 含量，結果RSD=0.65%，表明方法重復性良好。

回收率實驗:精確稱取0.03 mg 大黃酚，共6份，與不同濃度的Chr-M-β-CD 樣品溶液混合，HPLC測定Chr 濃度，平均加樣回收率98.10%，RSD=1.28%。

2 結果與分析

2.1 Chr-M-β-CD 包合物的相溶解度分析

包合常數(Kb)和結合摩爾比是表征小分子藥物與環(huán)糊精及其衍生物形成包合物的重要參數，相溶解度分析被廣泛用于評價上述兩個參數［8］。以CChr(mmol/L)為縱坐標，以CM-β-CD(mmol/L)為橫坐標，繪制相溶解度圖，分別得到25、35 和45 ℃時Mβ-CD 不同濃度對Chr 的相溶解度圖，結果見圖2(A)。采用線性回歸擬合發(fā)現(xiàn)，擬合R2均＞0.95。根據Higuchi 等［7］的報道，環(huán)糊精包合物的相溶解度曲線一般分為A 型和B 型?？腕w濃度隨環(huán)糊精濃度增大而增加的為A 型，表現(xiàn)為增溶作用，進一步分為3個亞型:AL、AP和AN型。若環(huán)糊精對客體以物質的量之比為1∶1 進行包合，相溶解度曲線呈線性增加，表現(xiàn)為AL型，而AP和AN分別為線性增加的正偏差和負偏差。圖2(A)顯示，Chr 在不同濃度M-β-CD 作用下的相溶解度圖曲線為線性AL型;隨著M-β-CD 濃度的增加，Chr 的溶解度隨之增加，且有較好的線性關系。圖2(B)說明Chr 與M-β-CD形成了物質的量之比為1∶1 的包合物。

圖2 Chr-M-β-CD 包合物在不同溫度下的相溶解度曲線(A)和等摩爾連續(xù)遞變曲線(B)(n=6)Fig.2 Phase solubility diagram (A)and continuous variation plot (B)of Chr-M-β-CD+at different temperatures

Chr-M-β-CD 超分子包合常數(Kb)是衡量包合物穩(wěn)定性的重要參數，Kb越大，表明該藥物與空腔分子的結合越穩(wěn)定，越容易形成包合物。根據線性方程和式(1)得出包合物在25、35 和45 ℃條件下的Kb分別為:6.56 ×102、7.85 ×102、1.09 ×103L/mol。Kb隨溫度的升高而升高，這可能是由于分子間作用力(客體Chr 與空腔M-β-CD 間的范德華力、疏水客體與空腔問的“疏水性鍵力”等)的減小造成的［9］。鄭曉霞等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Chr-HP-β-CD 的Kb為401.19 L/mol(研究條件為:25 ℃)，比較發(fā)現(xiàn)Mβ-CD 對Chr 的包合作用更強。Loftsson 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，當環(huán)糊精及其衍生物對藥物的包合常數在50 L/mol～2000 L/mol 范圍內，說明二者之間有較強的相互作用。

2.2 Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數分析

以lnKb對1/T 作線性回歸，得線性回歸方程為lnKb=– 2.416 ×103/T +14.57(R2=0.9655)。Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數結果見表1。實驗結果顯示△G0＜0，說明Chr 與M-β-CD 包合過程是一個自發(fā)過程;△H0＞0，說明包合過程是一個吸熱過程;△S0＞0，說明包合過程是無序化增加的過程。同時實驗結果說明Chr 與M-β-CD 包合過程為熵驅動過程。環(huán)糊精及其衍生物的包合增溶作用主要通過對客體小分子的包結作用實現(xiàn)，包合物形成是增溶的前提［12］。包合過程實質是客體分子Chr進入M-β-CD 空腔，并將其中的水分子替換出來的過程，包合的主要驅動力來自于空腔內高焓值水的釋放，包合物的形成可能是Chr 與M-β-CD 間多種力相互作用的結果，如氫鍵、范德華力、疏水相互作用，以及M-β-CD 在包合過程中釋放的環(huán)張力等。

表1 不同溫度下Chr 與M-β-CD 包合過程的熱力學參數Table 1 The thermodynamic parmeters of Chr-M-β-CD inclusion complex under different temperatures

圖3 大黃酚及大黃酚包合物累積釋放曲線(n=6)Fig.3 Dissolution profiles of Chr and its inclusion complex

2.3 Chr-M-β-CD 包合物體外釋放特性分析

從圖3 可知，Chr 原藥在介質中的溶出行為很差，200 min 在介質中的累積釋放率僅為19.9%。物理混合物中由于水溶性輔料的存在，改善了Chr的表面潤濕性，對藥物的溶出有所改善，但最終的累積釋放率也僅為43.6%。采用電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備Chr-M-β-CD 包合物，可以顯著提高Chr原藥的初期釋放率和最終的累積釋放率。ES 方法將藥物溶液在熱氣流的作用下使霧滴中的水分迅速蒸發(fā)，直接獲得疏松的干燥品，免去了后期其它加工工藝，且得到的粉末大部分為液滴經過膨脹產生的空心顆粒，有利于粉末的潤濕，能更好的改善藥物的累積釋放率。

3 結論

經過電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備的Chr-甲基化-β-環(huán)糊精(M-β-CD)包合物提高了Chr 溶解和溶出行為，不同溫度下Chr 的相溶解度圖均呈現(xiàn)出AL型特點。在25、35 和45 ℃條件下Chr 與M-β-CD 包合過程的超分子包合常數分別為6.56 ×102、7.85 ×102、1.09 ×103L/mol。包合過程的△H0為20.09 kJ/mol;△S0為121.11 J/(mol·K);△G0分別為-16.01、-17.21、-18.42 kJ/mol;M-β-CD 與Chr可自發(fā)形成質量比為1∶1 的包合物，整個包合過程體現(xiàn)為熵驅動過程，形成的超分子包合物均有較好的增溶作用，為Chr 的口服新劑型的設計提供新的思路。同時電磁攪拌-噴霧干燥法(ES)制備得到的Chr-M-β-CD 包合物粉末大多為液滴經膨脹產生的空心顆粒，有利于被水潤濕電磁攪拌-噴霧干燥法制品較有工業(yè)化前景。

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