大蒜素對(duì)小鼠脾細(xì)胞雌激素和雄激素受體影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉靈燕，董 群

皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，蕪湖 241002

大蒜(Garlic)作為調(diào)味品在民間廣泛應(yīng)用，現(xiàn)代科學(xué)證明大蒜具有多種有益健康的生物活性:抗氧化、抗細(xì)菌、抗寄生蟲、抗腫瘤、降低血脂和抑制血小板聚集等［1-3］。大蒜素是大蒜中的主要生物活性成分，其化學(xué)名稱為二烯丙基三硫化物。神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)是機(jī)體的三大調(diào)節(jié)系統(tǒng)，這三大系統(tǒng)看似獨(dú)立，實(shí)際上是一個(gè)有著廣泛聯(lián)系的有機(jī)整體，三者之間相互交織、相互協(xié)調(diào)、相互影響，構(gòu)成一個(gè)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)［4］。大蒜素對(duì)免疫系統(tǒng)影響的研究較多，但是關(guān)于大蒜素對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可上調(diào)小鼠ACTH 和CORT 的表達(dá)［5］，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)通過給青年小鼠灌服大蒜素后，觀察小鼠脾細(xì)胞上雌激素受體(ERα 和ERβ)和雄激素受體(AR)mRNA 的表達(dá)水平變化情況，來探討大蒜素對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR 清潔雄性和雌性小鼠(批號(hào)為SCXK 蘇2007-0001)，體重為18～20 g，6 周齡，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

大蒜素膠囊，由江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為H32025683)，規(guī)格:20 mg/粒。

1.3 試劑

總RNA 抽提試劑，cDNA 第一鏈合成試劑盒，PCR 試劑，購自北京天根公司;AR、ERα、ERβ、GAPDH 上下游引物，由南京金斯瑞設(shè)計(jì);瓊脂糖(加拿大BIO BASIC INC.公司);氯仿(上海博河精細(xì)化學(xué)品有限公司);異丙醇無錫市展望化工試劑有限公司);無水乙醇(天津市東麗區(qū)季明莊工業(yè)園區(qū))等。

1.4 主要儀器

PCR 擴(kuò)增儀(英國Techne 公司);電泳儀(Bio Rad 公司);Gel Doc1000 凝膠成像系統(tǒng)(Bio Rad 公司);高速冷凍離心機(jī)(上海良平儀器儀表有限公司);生物安全柜(ESCO 公司);-80 ℃冰箱(中科美菱公司);冰箱(無錫松下冷機(jī)有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按性別隨機(jī)分成3 組實(shí)驗(yàn)組和3 組對(duì)照組。

2.2 灌服大蒜素

大蒜素對(duì)小鼠用藥的一般劑量為25 mg/kg·d［6］，0.4 mL/只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每只分別灌服大蒜素0.4 mL×14 d(25 mg/kg)、0.4 mL×21 d、0.4 mL×28 d，對(duì)照組同期分別灌服等體積的生理鹽水。

2.3 取標(biāo)本

小鼠處死后，無菌取脾，于4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗除去血液后，用濾紙吸干多余水分，稱取約50 mg 脾組織加入到1 mL TRIZOL 總RNA 提取試劑中，置-80 ℃冰箱保存。

2.4 脾細(xì)胞ERα、ERβ 和AR mRNA 表達(dá)水平的檢測

2.4.1 小鼠脾細(xì)胞總RNA 的抽提

將已加有TRIZOL 的脾組織充分勻漿，然后倒入1.5 mL 無菌無RNA 酶的離心管中，12000 rpm，4℃，離心10 min，吸取上清于另一干凈離心管中，棄沉淀;加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩1 min，室溫靜置15 min，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，用微量加樣器取上清液，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無菌無RNA 酶的1.5 mL離心管內(nèi);每管加入500 μL 異丙醇，混勻，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，棄上清液;加入75% 乙醇(DEPC 水配制)1 mL，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)洗滌離心管，12000 rpm，4 ℃，離心10 min，盡量棄上清;室溫晾干5 min;加入30 μL DEPC 水溶解沉淀，充分混勻，低速簡短離心使沉淀沉降;于-20 ℃保存。

2.4.2 cDNA 合成(逆轉(zhuǎn)錄)

反應(yīng)總體積(20 μL):先取2 μL 模板RNA、2 μL Oligo(dT)15(10μM)引物、2 μL dNTP(2.5 mM)、8.5 μL ddH2O，72 ℃反應(yīng)5 min 后迅速置于冰上放置2 min，然后逐一加入以下成分:4 μL 5 ×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.5 μL RNA 酶抑制劑(2 U)、1 μL M-MLV(200 U)。42 ℃反應(yīng)50 min，95 ℃反應(yīng)5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)于-20 ℃保存。

2.4.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

小鼠ERα 基因上游引物序列:5'-CGCCTTCTACAGGTCTAAT-3'，

下游引物序列:5'-GGTTCTTGTCAATGGTGC-3';

小鼠ERβ 基因上游引物序列:5'-CTTGGTCACGTACCCCTTAC-3'，

下游引物序列:5'-GTATCGCGTCACTTTCCTTT-3';

小鼠AR 基因上游引物序列:5'-CCATCCAAGACCTATCGAGG-3'，

下游引物序列:5'-TGAGTCATCCTGATCTGGAG-3';

小鼠內(nèi)參GAPDH 上游引物序列:5'-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3'，

下游引物序列:5'-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。ERα 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為257bp，ERβ 為245bp，AR為為369 bp，GAPDH 為530 bp。

2.4.4 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系(25 μL):模板cDNA 2 μL，2 ×Taq PCR MasterMix(內(nèi)含0.1 U Taq Polymerase/μL，500 μM dNTP，20 mM Tris-HCL(pH 8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2)，上、下游引物(10 μM)各0.5 μL，加ddH2O 至總體積25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃，5 min;94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃，10 min。PCR 產(chǎn)物于-20 ℃保存。取10 μL PCR 產(chǎn)物加樣，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(用2000 bp PCR marker 作為分子大小參照物，100 V 穩(wěn)壓電泳40 min)，紫外燈下觀察結(jié)果。經(jīng)凝膠分析系統(tǒng)Quantity One 掃描后，以GAPDH mRNA 的RTPCR 產(chǎn)物作為內(nèi)參照，測定RT-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Adj.Vol.值(即為減去背景色后的條帶光強(qiáng)度值)，進(jìn)行目的基因擴(kuò)增片段與對(duì)照基因擴(kuò)增片段Adj.Vol.值的比較［7］。以目的基因的cDNA 與GAPDH 的cDNA 灰度掃描值的比值代表其最終受體的mRNA表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有測定結(jié)果用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。兩組間同一時(shí)點(diǎn)各對(duì)應(yīng)指標(biāo)的比較采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大蒜素對(duì)雌性小鼠脾細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)水平的影響

如圖1、2 結(jié)果顯示，與同一時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比，灌服14 d 和21 d 時(shí)，雌性小鼠脾細(xì)胞ERα mRNA 表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);灌服14 d 時(shí)，雌性小鼠脾細(xì)胞ERβ mRNA 表達(dá)水平明顯明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);灌服28 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞ERα、ERβ mRNA 表達(dá)水平變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);隨灌服時(shí)間的延長，ERα mRNA 水平有上升趨勢(shì)。各雌性小鼠脾細(xì)胞ERα、ERβ mRNA 與GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖見圖3～6。

圖1 雌性小鼠脾細(xì)胞ERα mRNA 表達(dá)水平Fig.1 ERα mRNA expression level in the spleen cells of female mouse

圖2 雌性小鼠脾細(xì)胞ERβ mRNA 表達(dá)水平Fig.2 ERβ mRNA expression level in the spleen cells of female mouse

圖3 14 d 雌性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 14 d female control and experimental groups

圖4 21 d 雌性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 21 d female control and experimental groups

圖5 28 d 雌性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠ERα、ERβ、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electropherograms of RT-PCR products of ERα，ERβ，GAPDH mRNA in 28 d female control and experimental groups

3.2 大蒜素對(duì)雄性小鼠脾細(xì)胞AR mRNA 表達(dá)水平的影響:

如圖6 顯示，與同一時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比，灌服大蒜素14、21 和28 d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾細(xì)胞AR mRNA表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨灌服時(shí)間的延長，小鼠脾細(xì)胞AR mRNA 表達(dá)水平有下降趨勢(shì)。各雄性小鼠脾細(xì)胞AR mRNA 與GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖見圖7～9。

4 討論

雌激素、雄激素屬于類固醇激素，廣泛存在于人體各個(gè)組織器官，在發(fā)育和維持身體正常機(jī)能方面發(fā)揮著重要作用。雌激素只有與雌激素受體結(jié)合(雄激素只有與雄激素受體結(jié)合)才能發(fā)揮作用，雌激素受體可分為經(jīng)典受體(主要包括ERα 和ERβ)和膜受體(membrane ER，mER)。雄激素受體也可分為經(jīng)典受體(AR)和膜受體(membrane AR，mAR)。經(jīng)典的ER、AR 屬于核受體超家族，該家族成員在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定的相似性。

圖6 雄性小鼠脾細(xì)胞AR mRNA 表達(dá)水平Fig.6 AR mRNA expression level in the spleen cells of male mouse

圖7 14 d 雄性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AR，GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.7 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 14 days male control and experimental groups

圖8 21 d 雄性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AR、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.8 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 21 days male control and experimental groups

圖9 28d 雄性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組AR、GAPDH mRNA 的RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.9 Electropherograms of RT-PCR products of AR and GAPDH mRNA in 28 days male control and experimental groups

近年的研究發(fā)現(xiàn)，ERα、ERβ 和AR 廣泛存在于機(jī)體多處免疫組織中，如骨髓組織、胸腺組織，非胸腺淋巴樣組織、內(nèi)分泌系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及具有重要調(diào)節(jié)功能的下丘腦腹側(cè)核，但其表達(dá)量在不同免疫細(xì)胞甚至在細(xì)胞的不同分化階段均有所不同。越來越多的證據(jù)表明，雌激素和雄激素參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，在機(jī)體免疫功能和免疫介導(dǎo)性疾病中起重要作用。例如，免疫反應(yīng)的性別差異、去勢(shì)后免疫應(yīng)答的改變、免疫器官和細(xì)胞上存在性激素受體以及自身免疫性疾病發(fā)病的性別差異等。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠脾細(xì)胞和人類T 淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上均有ERα、ERβ 和AR 的表達(dá)，且國外文獻(xiàn)還報(bào)道在創(chuàng)傷出血、自身免疫性疾病(如紅斑狼瘡)的T 淋巴細(xì)胞上ERα 和ERβ 的表達(dá)與T 細(xì)胞功能有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)更年期綜合癥患者外周血白細(xì)胞ER 含量明顯降低，使機(jī)體免疫力低下，而血管中ER 數(shù)目減少是絕經(jīng)前女性冠心病易患因素之一。這些都表明ER、AR 與免疫系統(tǒng)存在緊密聯(lián)系，但是雌激素、雄激素作用于免疫系統(tǒng)哪些基因及其作用方式、與之相互作用的組織細(xì)胞特異性因子、下游調(diào)控的目的基因等問題還有待進(jìn)一步研究。研究雄激素受體、雌激素受體與免疫系統(tǒng)的關(guān)系將有助于了解免疫系統(tǒng)的發(fā)育機(jī)制、免疫老化機(jī)制及自身免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制，并對(duì)雌、雄激素在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用前景提供一定科研基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過給小鼠灌服大蒜素后，用逆轉(zhuǎn)入聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測小鼠脾細(xì)胞上ERα、ERβ 和AR mRNA 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠脾細(xì)胞上有ERα、ERβ 和AR 的表達(dá)，這與Benten［8］和Piesta［9］的研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大蒜素可以提高小鼠脾細(xì)胞上ERα、ERβ 和AR mRNA 的表達(dá)水平。提高脾細(xì)胞上ER、AR mRNA的表達(dá)水平，可以增強(qiáng)E-ER、A-AR 生物學(xué)效應(yīng)，提高雌激素、雄激素對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。目前關(guān)于大蒜素對(duì)雌激素、雄激素受體影響的研究較少，Stan［10］研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以降低小鼠前列腺癌細(xì)胞上AR 的表達(dá)水平，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論不一致，推測可能是由于在本實(shí)驗(yàn)中采用的是脾細(xì)胞，以及大蒜素是作用在正常小鼠體內(nèi)，而不是病理狀態(tài)等因素造成。本實(shí)驗(yàn)首次研究大蒜素對(duì)正常小鼠脾細(xì)胞ERα、ERβ 和AR mRNA 表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，提示大蒜素可以通過內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1 Fujisawa H，Watanabe K，Suma K，et al.Antibacterial potential of garlic-derived allicin and its cancellation by sulfhydryl compounds.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73:1948-1955.

2 Miron T，Mironchik M，Mirelman D，et al.Inhibition of tumor growth by a novel approach:in situ allicin generation using targeted alliinase delivery.Mol Cancer Ther，2003，2:1295-1301.

3 Sher A，F(xiàn)akhar-ul-Mahmood M，Shah SN，et al.Effect of garlic extract on blood glucose level and lipid profile in normal and alloxan diabetic rabbits.Adv Clin Exp Med，2012，21:705-711.

4 Besedovsky HO.Changes in blood hormones during the immune response.Proc Soc Exp Biol Med，1988，15:466-471.

5 Lv YN(呂亞囡)，Dong Q(董群).Effects of garlic on plasma ACTH and CORT of mice.Acta Acade Med Wannan (皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào))，2012，31(2):89-91.

6 Xu SY(徐叔云)，Bian RL(卞如濂)，Chen X(陳修).Pharmacology Experiment Method (藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)).Beijing:People's Medical Publishing House，1991.178-179.

7 Li TC(李鐵臣)，Zhu YL(朱延齡)，Gong L(宮磊)，et al.Expression of ING4 gene in human glioma.J Prac Med (實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志)，2008，24:1508-1510.

8 Benten WP，Stelkaan C，Wunderlich F.B cells express intracellular but not surface receptors for testosterone and estradiol.Steroids，2002，67:647-654.

9 Piesta A，Maj T，Che?mońska-Soyta A.The influence of mating on estrogen receptor alpha protein level in spleen and uterine macrophages in female mice.Reprod Biol，2009，9:225-240.

10 Stan SD，Singh SV.Transcriptional repression and inhibition of nuclear translocation of androgen receptor by diallyl trisulfide in human prostate cancer cells.Clin Cancer Res，2009，15:4895-4903.