味噌異黃酮類化學(xué)成分

陳權(quán)威，田 瑛，高 婷，陳恒文，董俊興*

1中南大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410013;2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

味噌是一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵產(chǎn)品，其發(fā)酵過程與日本的miso，韓國的chungkookjang，doenjang，kochujang 等相似，在亞洲國家，作為調(diào)味品一直被廣泛使用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，大豆的發(fā)酵產(chǎn)品不僅天然、營養(yǎng)、安全，而且藥理作用豐富，如抗氧化、抗癌變、抗高血壓、降血糖、抗糖尿病等［1-5］，具有潛在的藥用價值。為闡明大豆發(fā)酵產(chǎn)品的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，對味噌正丁醇萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。本文主要介紹分離得到的6 個異黃酮類化合物:染料木素(1)、大豆素(2)、黃豆黃素(3)、4'，5，7，8-四羥基異黃酮(4)、4'，7，8-三羥基異黃酮(5)、4'，7，8-三羥基-6-甲氧基異黃酮(6)，化合物1～6均為首次從味噌中分離得到。

1 儀器與材料

供試樣品購買于大連松井味噌有限公司。標(biāo)本存放于本實驗室。

Varian UNITY INOVA 600 超導(dǎo)核磁共振譜儀(美國Varian 公司)，TMS 為內(nèi)標(biāo);Finnigan LCQ Advantage Max 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Finnigan 公司);BP211D 電子天平(美國Sartorius 公司);Sephadex LH-20 凝膠(瑞士Pharmacia 公司);薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠200～300 目(青島海洋化工廠);所用試劑為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

將購買的味噌原料100 Kg 用95 %乙醇回流提取3 次，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏7.8 Kg。取浸膏1500 g 用蒸餾水溶解后依次用石油醚和正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚部位251 g、正丁醇部位250 g 和水部位960 g。取正丁醇部位244 g，經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇梯度洗脫，20∶1，10∶1，5∶1，5∶2，1∶1)分離，并用薄層色譜進(jìn)行檢測，合并相似組分得到fractions A～E 五個流分。Fr.B 經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇梯度洗脫，20∶1，10∶1，5∶1)分離以及重結(jié)晶，得到化合物1(1200 mg)。Fr.C 經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇梯度洗脫，20∶1，10∶1，5∶1)和凝膠柱色譜(氯仿-甲醇1 ∶1 洗脫)分離，得到化合物2(1000 mg)和化合物3(20 mg)。Fr.D 經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇梯度洗脫，15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，4∶1)、凝膠柱色譜(氯仿-甲醇1∶1 洗脫)、PHPLC(甲醇-水35∶65)分離得到化合物4(21 mg)、5(36 mg)和6(4 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陽性。分子式C15H10O5，ESI-MS m/z:271［M+H］+，269［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.22 (1H，s，H-6)，6.38 (1H，s，H-8)，6.81 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3'，5')，7.37 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2'，6')，8.33 (1H，s，H-2)，9.63 (1H，s，OH-4')，10.83 (1H，s，OH-7)，12.96 (1H，s，OH-5);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:93.6 (C-8)，98.9 (C-6)，104.4 (C-10)，115.0 (C-3'，5')，121.2 (C-3)，122.2 (C-1')，130.1 (C-2'，6')，153.9 (C-2)，157.4 (C-5)，157.5 (C-9)，162.0 (C-4')，164.2(C-7)，180.2 (C-4)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻(xiàn)［6］比較，鑒定化合物1 為染料木素(genistein)，即4'，5，7-三 羥基異黃酮(4'，5，7-trihydroxy isoflavone)。

化合物2 黃色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陰性。分子式C15H10O4，ESI-MS m/z:255［M+H］+，253［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.81 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，6.87 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.84 (1H，dd，J=2.2，9.0 Hz，H-6)，7.38 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，7.97(1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，8.30 (1H，s，H-2)，9.55(1H，s，OH-4')，10.81 (1H，s，OH-7);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:102.1 (C-8)，115.0 (C-3'，5')，115.2 (C-6)，116.7 (C-10)，122.6 (C-3)，123.5 (C-1')，127.3 (C-5)，130.1 (C-2'，6')，152.4 (C-4')，152.9 (C-2)，157.5 (C-9)，163.1(C-7)，174.8 (C-4)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻(xiàn)［6］比較，鑒定化合物2 為大豆素(daidzein)，即4'，7-二羥基異黃酮(4'，7-dihydroxy isoflavone)。

化合物3 白色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陰性。分子式C16H12O5，ESI-MS m/z:285［M+H］+，283［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:3.87 (3H，s，OCH3)，6.80 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3'，5')，6.93 (1H，s，H-8)，7.38 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2'，6')，7.42 (1H，s，H-5)，8.27 (1H，s，H-2)，9.49 (1H，s，OH-4')，10.54 (1H，s，OH-7);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:55.8 (OCH3)，102.8(C-8)，104.7 (C-5)，114.9 (C-3'，5')，116.2 (C-10)，122.7 (C-1')，122.9 (C-3)，130.0 (C-2'，6')，146.9 (C-6)，151.7 (C-9)，152.4 (C-2)，152.8 (C-7)，157.1 (C-4')，174.3 (C-4)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻(xiàn)［7］比較，鑒定化合物3 為黃豆黃素(glycitein)，即4'，7-二羥基-6-甲氧基異黃酮(4'，7-dihydroxy-6-methoxy isoflavone)。

化合物4 黃色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陽性。分子式C15H10O6，ESI-MS m/z:287［M+H］+，285［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.28 (1H，s，H-6)，6.81 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，7.37 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，8.35(1H，s，H-2)，8.72 (1H，s，OH-7)，9.55 (1H，s，OH-4')，10.52 (1H，s，OH-8)，12.36 (1H，s，OH-5);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:98.7 (C-6)，104.1(C-10)，115.0 (C-3'，5')，121.4 (C-3)，121.8 (C-1')，124.9 (C-8)，130.2 (C-2'，6')，145.9 (C-9)，153.2 (C-7)，153.5 (C-5)，153.8 (C-2)，157.3 (C-4')，180.1 (C-4)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻(xiàn)［8］比較，鑒定化合物4 為4'，5，7，8-四羥基異黃酮(4'，5，7，8-tetrahydroxy isoflavone)。

化合物5 黃色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陽性。分子式C15H10O5，ESI-MS m/z:271［M+H］+，269［M-H］-;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:6.79 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，6.94 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，7.37 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，7.46 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，8.32 (1H，s，H-2)，9.40 (1H，s，OH-7)，9.49 (1H，s，OH-4')，10.27 (1H，s，OH-8);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:114.1 (C-6)，114.9 (C-3'，5')，115.6 (C-5)，117.4 (C-10)，122.6 (C-3)，122.9 (C-1')，130.0 (C-2'，6')，132.8 (C-8)，146.7 (C-9)，149.9(C-7)，152.6 (C-2)，157.1 (C-4')，175.1 (C-4)。通過波譜數(shù)據(jù)分析并與文獻(xiàn)［8］比較，鑒定化合物5為4'，7，8-三羥基異黃酮(4'，7，8-trihydroxy isoflavone)。

化合物6 黃色粉末，易溶于甲醇，F(xiàn)eCl3顯色反應(yīng)呈陽性。ESI-MS m/z:301［M +H］+，299［MH］-，結(jié)合1H NMR、13C NMR 譜確定其分子式為C16H12O6，不飽和度為11。由化合物6 的1H NMR 和13C NMR(表1)顯示，δH8.28(1H，s)為異黃酮2 位的特征氫信號，碳譜上δC152.3 為2 位碳的信號。δH6.80(2H，d，J=9.0 Hz)和7.38(2H，d，J=9.0 Hz)的兩對芳香質(zhì)子成AA'BB'耦合系統(tǒng)，為異黃酮分子母核B 環(huán)上兩對碳δC114.9(C-3'，5')和130.1(C-2'，6')的四個氫，同時可判斷B 環(huán)為對位取代。δH3.87(3H，s)為甲氧基的特征氫信號。δH7.04(1H，s)為母核A 環(huán)上的芳香質(zhì)子，δH9.50(3H，br s)為三個羥基質(zhì)子，δC174.6 為羰基碳(C-4)的特征碳信號。通過HMBC 遠(yuǎn)程相關(guān)譜發(fā)現(xiàn)，羰基碳(δC174.6，C-4)與芳香質(zhì)子(δH7.04，1H，s)相關(guān)，說明此芳香質(zhì)子是5 位碳上的質(zhì)子，同時還發(fā)現(xiàn)此質(zhì)子與δC140.0、142.5 和146.8 的三個碳呈遠(yuǎn)程相關(guān)，結(jié)合文獻(xiàn)，確定這三個碳分別為7 位、9 位和6 位碳。進(jìn)一步觀察，可見6 位碳和甲氧基呈遠(yuǎn)程相關(guān)，故確定6 位碳被甲氧基取代。剩下的三個羥基分別取代4'位、7 位和8 位。綜上所述，數(shù)據(jù)歸屬為:1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:3.87 (3H，s，OCH3)，6.80 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，5')，7.04 (1H，s，H-5)，7.38 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，6')，8.28 (1H，s，H-2)，9.50 (3H，br s，OH-4'，7，8);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:55.8 (OCH3)，95.1 (C-5)，114.9 (C-3'，5')，115.9 (C-10)，122.6 (C-3)，122.9 (C-1')，130.1 (C-2'，6')，133.7 (C-8)，140.0 (C-7)，142.5 (C-9)，146.8 (C-6)，152.3 (C-2)，157.0 (C-4')，174.6 (C-4)。與文獻(xiàn)［9］比較，鑒定化合物為4'，7，8-三羥基-6-甲氧基異黃酮(4'，7，8-trihydroxy-6-methoxy isoflavone)。

圖1 化合物1～6 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structures of compounds 1-6

4 討論

大豆發(fā)酵產(chǎn)品豐富的生理調(diào)節(jié)作用與其物質(zhì)基礎(chǔ)密切相關(guān)，其中異黃酮類化合物是重要的藥理活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，未發(fā)酵大豆中異黃酮類化合物主要以糖苷形式存在(如染料木苷、大豆苷及黃豆黃苷)，經(jīng)發(fā)酵后，其異黃酮糖苷易被水解成相應(yīng)的異黃酮苷元(即染料木素、大豆素及黃豆黃素)［10，11］，并且在微生物二次代謝作用下可能生成新的異黃酮苷元。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵生成的異黃酮苷元脂溶性增強(qiáng)，更容易被機(jī)體吸收和利用，且更易透過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生作用，從而提高藥物的生物利用度和活性［11］。體外研究發(fā)現(xiàn)，4'，5，7，8-四羥基異黃酮和4'，7，8-三羥基異黃酮的8 位羥基被糖取代后，其抑制絡(luò)氨酸酶的活性便散失［8］;染料木素對MCF-7和BT20 乳腺腫瘤細(xì)胞具有抗腫瘤的作用，而糖苷型的染料木苷未表現(xiàn)抗腫瘤的活性［12］。

本文研究味噌的異黃酮類化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，化合物1～3 是由大豆原有的三種異黃酮糖苷水解而來;化合物4～6 的母核結(jié)構(gòu)在未發(fā)酵大豆中不存在相應(yīng)的糖苷，因此化合物4～6 可能是微生物二次代謝生成的新物質(zhì)。

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