蛇床子配伍維生素C 對大鼠運動性腎臟缺血再灌注的保護(hù)作用

郭愛民，曹建民，周海濤

1中國石油大學(xué)(北京)，北京 102249;2 北京體育大學(xué)，北京 100084;3 北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展、現(xiàn)代藥理學(xué)理論及現(xiàn)代生物技術(shù)的更新，更多的單劑或配伍組方應(yīng)用于體育實踐。中藥以其多靶點、多途徑作用且?guī)缀醪缓`禁成分的特點日益顯示出其獨特的優(yōu)勢，在提高運動員身體機能及緩解疲勞方面取得了一定的成就。

機體在穩(wěn)定狀態(tài)下，腎血流量可以通過自身調(diào)節(jié)機制來維持相對恒定。在劇烈運動時，腎血流在神經(jīng)和體液因素的影響下發(fā)生改變。由于各器官血流量重新分配，使活動器官特別是肌肉的血流量增多，腎血流量急劇下降，并伴隨運動過程的持續(xù)和強度遞增表現(xiàn)的更加明顯［1］。腎臟的這種不完全缺血狀態(tài)形成了“運動性腎缺血”。運動停止后，腎血供應(yīng)恢復(fù)形成運動性腎缺血后的“再灌注”［2］。缺血再灌注損傷過程中，自由基的產(chǎn)生異常增多起著重要作用。研究表明，蛇床子具有較高的抗氧化活性，可以清除體內(nèi)過量生成的自由基對機體細(xì)胞的損傷［3］，維生素C 作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以有效清除自由基［4］。本文研究蛇床子配伍維生素C對大鼠缺血再灌注腎臟的影響，并探討二者在缺血再灌注損傷中的作用及其機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物

清潔級雄性Wistar 大鼠100 只，42 d 齡，平均體重(196.7 ±12.1)g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，許可證號SCXK(京)2006-0008。在整個試驗過程中，實驗室內(nèi)溫度保持在(22 ±2)℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。所有試驗大鼠均以基礎(chǔ)飼料(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供)和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。試驗時間為63 d，正式訓(xùn)練時間為56 d。

1.2 試驗用藥

蛇床子(Fructus Cnidii)，產(chǎn)自河北，北京同仁堂購得，批號:120314457 并經(jīng)天津中瑞藥業(yè)有限公司高占友高級工程師鑒定。稱取定量中藥，煎煮過濾，60 ℃水浴中濃縮成1 g(生藥)/mL，4 ℃存放備用。

1.3 試劑

血清肌酐(serum creatinine，Scr)采用Jaffe 苦味酸法測定，血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)采用二乙酰-肟法測定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)采用比色法測定;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，采用黃嘌呤氧化酶法測定，均采用南京建成生物工程研究所提供試劑盒，試劑盒編號20120509，并嚴(yán)格按照使用說明操作。

1.4 儀器

BS224S 型電子分析天平(德國賽多利斯);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS 公司);ALCYON300 全自動生化分析儀(美國雅培);756M C 型紫外-可見分光光度計(上海精密儀器廠);GL-20G 高速冷凍離心機(上海安亭)。

2 試驗方法

2.1 動物分組

實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d 后，以20 min/d 的運動量對其進(jìn)行為期3 d 的篩選，淘汰個別不適應(yīng)游泳訓(xùn)練者，將剩余大鼠以數(shù)字隨機分組法分6 組:對照組(C 組)12 只，一般訓(xùn)練組(M 組)12 只，過度訓(xùn)練組(OM 組)24 只，蛇床子+過度訓(xùn)練組(FOM 組)16 只，維生素C +過度訓(xùn)練組(VCOM 組)16 只，蛇床子+維生素C+過度訓(xùn)練組(FVCOM 組)16 只進(jìn)行56 d 的游泳訓(xùn)練。訓(xùn)練期間，F(xiàn)OM 組、FVCOM 組采用專業(yè)灌胃器灌胃(ig)，每天一次，劑量為1.5 g/kg，ig 體積為5 mL/kg;VCOM 組、FVCOM 組采用腹腔注射(ip)，劑量為100 mg/kg，每天一次，注射體積為0.5 mL(通過預(yù)實驗獲得最佳劑量)，其他各組ig等量生理鹽水。

2.2 實驗方法

2.2.1 訓(xùn)練及測試方案

C 組常規(guī)飼養(yǎng)，不加任何干預(yù)，平時不運動。M組進(jìn)行中等強度游泳訓(xùn)練，正式游泳訓(xùn)練8 周。每周訓(xùn)練6 d，每天訓(xùn)練1 次，第一次下水游20 min，此后逐漸增加，至第1 周末時每天游60 min，第2 周末時加至每天游90 min，第3 周末時加至每天游120 min，此后5 周均保持此運動量。其他各組前3 周訓(xùn)練安排同M 組，第4 周起開始安排高強度訓(xùn)練。大鼠進(jìn)行負(fù)重游泳，每次訓(xùn)練至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s 不露出水面為度。第1～3 周負(fù)0.5%體重，第4 周負(fù)1%體重，第5 周負(fù)2%體重，每天訓(xùn)練1 次。第6 周每天上、下午各訓(xùn)練1 次，第7～8 周，每天上、下午、夜間各訓(xùn)練1 次，均負(fù)5%體重。至第8 周末，C、M 組大鼠，均正常生長，無意外死亡發(fā)生。其他各組大鼠因尾部負(fù)重，疲勞衰竭不能恢復(fù)及訓(xùn)練意外死亡等原因，死亡率較高。OM組、FOM 組、VCOM 組、FVCOM 組分別剩余14、13、11、12 只。各組分別取10 只用于實驗取材，其他隨機剔除。

2.2.2 指標(biāo)測定

各組大鼠于末次游泳訓(xùn)練24 h 后，乙醚適度麻醉，從頸總動脈處取血加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37℃水浴中30 min 后，4 ℃3000 rpm 離心10 min，分離制備血清，置-20 ℃冰箱中保存待查。迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，肉眼觀察腎臟大小，色澤、質(zhì)地。分離左腎，取腎上極組織0.5 g，用1.5 mL 生理鹽水在1 ℃下以12000 r/min 研磨制成10%腎組織勻漿;10%甲醛固定腎組織標(biāo)本，石蠟包埋，制成4 μm 厚切片，HE 染色，觀察組織病理學(xué)變化。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗;多組計量資料采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett's T3 法。P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 試驗結(jié)果

3.1 運動及蛇床子、維生素C 對大鼠腎組織的病理改變

Scr 和BUN 測定后取各組腎組織制作石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，腎臟病理變化評價參照Pallers 標(biāo)準(zhǔn)［5］，在400 倍光鏡下隨機選5 個視野，每個視野選10 個腎小管評分。1、腎小管明顯擴張，細(xì)胞扁平為1 分;2、刷狀緣損傷為1 分，脫落為2 分;3、細(xì)胞膜大泡1 分，細(xì)胞漿空泡1 分;4、間質(zhì)水腫1 分;5、腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞未形成管型或碎片為1 分，形成管型或碎片為2 分。腎小管評分由兩名技術(shù)員雙盲計算，取其平均值。光鏡下靜止對照組、一般訓(xùn)練組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，無淤血、變性和水腫，腎小管管腔內(nèi)無管型。過度訓(xùn)練組大鼠腎小球有淤血現(xiàn)象，小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性、管腔擴張，管腔中有少量的脫落絨毛和上皮細(xì)胞，以及各種管型。其他各組組織病理學(xué)改變較過度訓(xùn)練組輕，有輕微的小管上皮細(xì)胞水腫、空泡變性，管腔擴張現(xiàn)象，無蛋白管型和細(xì)胞管型。各組大鼠腎小管Paller［5］評分，靜止對照組、一般訓(xùn)練組組間無顯著差異(P ＞0.05)，靜止對照組、一般訓(xùn)練組明顯低于其他組(P ＜0.01)，治療組顯著低于過度訓(xùn)練組大鼠(P ＜0.05)，且均未見腎小球明顯病理改變。

表1 各組大鼠腎小管損害評分比較(n=10，)Table 1 Tubular damage score of different groups (n=10，)

表1 各組大鼠腎小管損害評分比較(n=10，)Table 1 Tubular damage score of different groups (n=10，)

注:與C 組比較，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;與OM 組比較，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)and 2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively.

3.2 運動及蛇床子、維生素C 對大鼠血清BUN 和SCr 的影響

表2 各組大鼠血清尿素氮和肌酐含量比較(n=10，)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and Serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups (n=10，)

表2 各組大鼠血清尿素氮和肌酐含量比較(n=10，)Table 2 Blood urea nitrogen(BUN)and Serum creatinine(SCr)levels in plasma of different groups (n=10，)

注:與C 組比較，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;與OM 組比較，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;與VCOM 組比較，5)表示P ＜0.05，6)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)and 2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P＜0.01;compared with VOCM group，5)and 6)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively.

由表2 可知:血尿素氮和血清肌酐各組較對照組明顯上升，與OM 組相比FOM 組、VCOM 組、FVCOM 組明顯下降，分別為P ＜0.05、P ＜0.05、P ＜0.01;與VCOM 組相比，F(xiàn)OM 組、FVCOM 組明顯下降，分別為P ＜0.05、P ＜0.01。

3.3 運動及蛇床子、維生素C 對大鼠腎組織勻漿中SOD 活性和MDA 含量的影響

由表3 可知:SOD 活性各組較對照組明顯降低，與OM 組相比FOM 組、VCOM 組、FVCOM 組明顯上升，分別為P ＜0.05、P ＜0.05、P ＜0.01;與VCOM組相比，F(xiàn)OM 組、FVCOM 組明顯上升，分別為P ＜0.05、P ＜0.01。MDA 含量各組較對照組明顯升高，

表3 各組大鼠腎組織勻漿中SOD 活性和MDA 含量比較(n=10，)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group (n=10，)

表3 各組大鼠腎組織勻漿中SOD 活性和MDA 含量比較(n=10，)Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in rat kidney homogenate of each group (n=10，)

注:與C 組比較，1)表示P ＜0.05，2)表示P ＜0.01;與OM 組比較，3)表示P ＜0.05，4)表示P ＜0.01;與VCOM 組比較，5)表示P ＜0.05，6)表示P ＜0.01。Note:compared with C group，1)and 2)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively;compared with OM group，3)and 4)represent P ＜0.05 and P＜0.01，respectively;compared with VOCM group，5)and 6)represent P ＜0.05 and P ＜0.01，respectively.

與OM 組相比FOM 組、VCOM 組、FVCOM 組明顯下降，分別為P ＜0.05、P ＜0.05、P ＜0.01;與VCOM 組相比，F(xiàn)OM 組、FVCOM 組明顯降低，分別為P ＜0.05、P ＜0.01。

4 討論

腎缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I/R)損傷是一個復(fù)雜的病理生理變化過程，其具體機制尚未完全闡明。但氧自由基(Oxygen free radicals，OFR)在I/R 發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用［6］。正常情況下，體內(nèi)可產(chǎn)生少量自由基，但由于體內(nèi)具有滅活自由基酶系統(tǒng)，自由基被迅速清除，不產(chǎn)生損傷作用。運動時由于I/R 使自由基產(chǎn)生增加，可引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜的液態(tài)性、流動性及通透性改變，進(jìn)而造成膜功能障礙，尤其是線粒體膜的破壞將影響細(xì)胞的代謝和機能，并干擾整個器官的生理功能。機體內(nèi)存在清除自由基、減輕其危害的主要物質(zhì)是抗氧化酶。SOD 是需氧生物體內(nèi)數(shù)千種酶中以氧自由基為底物的唯一酶。其通過催化超氧陰離子形成過氧化氫而清除超氧陰離子，保護(hù)機體免受損傷，同時在一定范圍內(nèi)，自由基代謝增強時，SOD 會代償性增加。因此SOD 活性的高低是機體抗氧化能力強弱的標(biāo)志。MDA 是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的一種主產(chǎn)物。組織線粒體MDA 含量是目前公認(rèn)的衡量機體自由基代謝的敏感指標(biāo)［7］。肌酐和尿素氮分別是肌肉和蛋白質(zhì)的分解代謝產(chǎn)物，主要經(jīng)血循環(huán)從腎臟排除體外，其血中的濃度取決于腎小球濾過能力，當(dāng)腎臟實質(zhì)受到損傷，腎小球濾過率降到臨界點后，二者的濃度就會明顯上升［8］。

實驗結(jié)果顯示，8 周的過度訓(xùn)練導(dǎo)致大鼠腎組織組織病理學(xué)發(fā)生明顯改變;血尿素氮、血清肌酐增高［過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+維生素C+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)高于靜止對照組］;SOD 活性降低［過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)低于靜止對照組］;MDA 含量升高［一般訓(xùn)練組(P ＜0.05)、過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)、蛇床子+維生素C +過度訓(xùn)練組(P＜0.05)高于靜止對照組］。說明過度訓(xùn)練已造成大鼠腎臟運動性缺血“再灌注”損傷，腎功能受到嚴(yán)重?fù)p壞。但腎組織組織病理學(xué)改變蛇床子+過度訓(xùn)練組、維生素C+過度訓(xùn)練組、蛇床子+維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)較過度訓(xùn)練組明顯減輕。血尿素氮和血清肌酐含量蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、蛇床子+維生素C+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)低于過度訓(xùn)練組;SOD 活性，蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、維生素C+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、蛇床子+維生素C+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)高于過度訓(xùn)練組;MDA 含量，蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)、蛇床子+維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)低于過度訓(xùn)練組。表明，蛇床子及維生素C 可以有效清除自由基，減輕腎臟的缺血缺氧，抑制脂質(zhì)過氧化作用，提高SOD 活性。有效減輕腎臟缺血再灌注損傷，起到保護(hù)作用。其機制可能為:1、蛇床子中所含蛇床子素(Osthole，Ost)具有較高的抗氧化活性，可以清除體內(nèi)過量生成的自由基對機體細(xì)胞的損傷，激活抗老化酶(SOD)的活性，降低脂質(zhì)過氧化物(lipid-hydroperoxide，LPO)的濃度，抑制脂褐素在組織細(xì)胞中的堆積［9］。2、蛇床子中含有大量而豐富的營養(yǎng)素，如黃酮類、多糖。黃酮類、多糖類等物質(zhì)對抗氧化、補充機體所需及防止細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化有一定的作用，可以有效地清除運動產(chǎn)生的過量自由基，避免了過剩自由基對機體細(xì)胞的損傷。二方面的聯(lián)合作用對清除機體自由基、減輕自由基對線粒體膜和肌漿網(wǎng)膜造成損傷起到積極作用［10］。3、維生素C 是重要的抗氧化維生素，作為強抗氧化劑可有效清除氧自由基、抑制凋亡級聯(lián)的啟動而減輕細(xì)胞、器官的缺血再灌注損傷［11］。此外，3 個治療組間比較，血尿素氮、血清肌酐、MDA 含量，蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)，蛇床子+維生素C+過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)低于維生素C+過度訓(xùn)練組;SOD 活性，蛇床子+過度訓(xùn)練組(P ＜0.05)，蛇床子+維生素C +過度訓(xùn)練組(P ＜0.01)高于維生素C +過度訓(xùn)練組。提示蛇床子對運動性腎臟缺血再灌注損傷的療效可能優(yōu)于維生素C;而二者配伍使用可能更有利于缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)。

綜上所述，蛇床子和維生素C 均對腎臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，可能是通過增強超氧化物歧化酶活性，清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而改善腎臟功能。就療效而言，二者配伍使用優(yōu)于二者單獨應(yīng)用，而蛇床子又優(yōu)于維生素C，但也可能和二者在應(yīng)用中的劑量大小有關(guān)，其劑量和療效之間的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

1 Barclar WF.Review of Medical Physiology.California:Lange Medical Publication，1995.577-580.

2 Heifets M，Davis TA，Tegtmeyer E，et al.Exercise training ameliorates progressive renal disease in rats with subtotal nephrectomy.Kidney Int，1987，32:815-820.

3 Wang WL(汪文來)，Yu ZM(于智敏)，Ju DH(鞠大宏)，et al.The Cnidium chemical and pharmacological research.Chin J Basic Med Trad Chin Med (中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志)，2011，17:704-706.

4 Palazzetti S，Rousseau AS，Richard MJ，et al.Antioxidant supplementation preserves antioxidant response in physical training and low antioxidant intake.Br J Nutr，2004，91:91-100.

5 Glaumann B，Trump BF.Studies on the pathogenesis of ischemic cell injury.III.Morphological changes of the proximal pars recta tubules (P3)of the rat kidney made ischemic in vivo.Virchows Arch B Cell Pathol，1975，19:303-23.

6 Wang L(王麗)，Mei CL(梅長林).Hypoxia-inducible factor-1α and oxygen free radicals in renal ischemia-reperfusion injury in rats.Chin J Nephrol(中華腎臟病雜志)，2006，22:371-373.

7 Chen PJ，Hirata F.The effects of long-term training at various loads on immunity and neuroendocrine responses in rats.J Nat Inst Fit Sport Kanoya Japan，1998，20:19-26.

8 Hong P(洪平)，Chen G(陳耿)，Li QZ(李清正)，et al.Influence of rapid weight loss by different temperature on certain biochemical indexes.Chin Sport Sci(體育科學(xué))，2010，30(4):44-48.

9 Wang SH(王書華)，An F(安芳)，Zhang DS(張丹參)，et al.An experimental study of antioxidant osthole.Chin Trad Pat Med(中成藥)，2005，27:488-489.

10 Zhong HY (鐘厚永).The experimental study on time-controled supplements of different Chinese traditional medicine acting on mice’s anti-fatique competince and organism.Guilin:Guangxi Normal University (廣西師范大學(xué))，MSc.2006.

11 Korkmaz A，Kolankaya D.The protective effects of ascorbic acid against renal ischemia-reperfusion injury in male rats.Ren Fail，2009，31:36-43.