響應(yīng)曲面優(yōu)化喜樹生物堿醇提工藝研究

余響華，蔣瓊鳳，邵金華

湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室 湖南科技學(xué)院，永州 425100

喜樹(Camptotheca acuminata)又名旱蓮、水栗、水桐樹、旱蓮子、野芭蕉等，屬藍果樹科(Nyssaceae)、喜樹屬(Camptotheca)，為我國特有植物，主要分布于長江以南地區(qū)［1］。喜樹中含有顯著、廣譜抗腫瘤活性［2］的生物堿物質(zhì)-喜樹堿(camptothecin，CPT)，它能夠穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶I-DNA 裂解復(fù)合物，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素DNA 的雙鏈裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［3］。CPT 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I 發(fā)揮細(xì)胞毒性的天然植物活性成分［4］。由于喜樹堿本身具有較大毒性，不能直接用于臨床治療，較為可行的是以喜樹堿為前體原料，通過合成高效低毒的衍生物以獲得新的抗癌藥物［5］。目前美國食品和藥物管理局(FDA)已批準(zhǔn)4 種喜樹堿衍生物CPT-11、TPT、9-AC、9-1NC 用于治療結(jié)腸/直腸癌及卵巢癌［6，7］，開發(fā)出的CPT 衍生物已成為繼紫杉醇后的又一類重要抗癌新藥。因此，對當(dāng)今抗癌新藥的原料藥-喜樹堿的研究仍具有十分重大的現(xiàn)實意義。

不同地區(qū)喜樹中喜樹堿含量差異性較大，湖南產(chǎn)喜樹果中CPT 在0.9%左右［8，9］。本研究以湖南產(chǎn)喜樹果為原材料，運用Design-Expert 7.0 軟件，建立正交實驗組，通過對實驗結(jié)果的分析優(yōu)化，建立了喜樹堿乙醇提取的最佳工藝條件，為喜樹堿的規(guī)?；a(chǎn)提供實驗參考。

1 材料與儀器

喜樹果，2013年11 月采摘自湖南永州，根據(jù)《中國植物志》的描述，結(jié)合咨詢2 位具有天然植物有效成分(藥用)方面的博士(姜紅宇、劉小文)，鑒定為喜樹果(Camptotheca acuminate fruit)，曬干后4℃低溫貯藏。

喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%，上海純優(yōu)生物，批號:P0281)、甲醇(色譜純)，氯仿、95%乙醇、無水乙醇、甲醇、NaOH、鹽酸均為AR 級;

主要設(shè)備與儀器:粉碎機、TG21KR 離心機、日本島津LC-10ATvP 高效液相色譜儀、Kromstar C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、予華儀器HH-WO 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HASUC DZF-6030 型真空干燥箱。

2 實驗方法

2.1 工藝流程

干燥、粉碎→乙醇回流浸提→減壓濃縮得浸膏→氯仿提取→減壓濃縮→甲醇回流提取→過濾，得不溶物→NaOH 溶解→離心，收集濾液→調(diào)酸→加甲醇，保溫析出→抽真空干燥→定容→HPLC 檢測。

2.2 原料及提取液的處理

2.2.1 原料的前處理

將采集到的喜樹果實經(jīng)60 ℃低溫干燥，控制水分在5%以下，粉碎過20 目篩，備用。

2.2.2 乙醇浸提流程

準(zhǔn)確稱取20.0 g 喜樹果粉末，按一定的料液比加入乙醇溶液回流浸提，收集浸提液，減壓濃縮得浸膏，加200 mL 氯仿震蕩提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收氯仿，干物質(zhì)經(jīng)200 mL 甲醇回流提取，抽真空過濾，用50 mL 2.5 mol/L 的NaOH 震蕩溶解濾渣部分，6500 rpm 離心5 min，取上清液，2.0 mol/L HCl調(diào)酸至pH 2.0～3.0，加200 mL 的甲醇震蕩析出喜樹堿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃蒸發(fā)至干，加甲醇(色譜級)溶解，定容于100 mL 容量瓶中，備用，HPLC 檢測。

2.3 喜樹堿含量的測定

2.3.1 標(biāo)品溶液配制

精確稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用10 mL 色譜級甲醇溶解，配成100 mg/L 母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3.2 HPLC 條件

流動相:甲醇∶水(v/v)=60∶40;流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm［10］，柱溫25 ℃，進樣量10μL。

2.3.3 樣品喜樹堿含量的測定

按上述色譜條件，吸取10 μL 樣品溶液，上HPLC 儀檢測。測得數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得樣品喜樹堿濃度，喜樹堿含量按下式計算:

式中，C 為樣品喜樹堿濃度(mg/L)，V 為樣品定容的體積(mL)，M 為稱取樣品質(zhì)量(g)。

2.4 乙醇浸提喜樹堿單因素實驗

設(shè)定其它條件不變的情況下，分別考察液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對喜樹堿得率的影響(表1)。

表1 喜樹堿乙醇提取單因素變化條件Table 1 Condition of single factor experiments for ethanol extraction

2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對喜樹堿提取率有顯著影響的3 個因素:料液比、乙醇濃度、提取時間，利用正交實驗結(jié)合Design-Expert 7.0 軟件分析上述3 個因索在3 個水平上對喜樹堿提取效果的影響，實驗設(shè)計如表所示。

表2 響應(yīng)面實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of RSM experiment

圖1 喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品(A)及樣品(B)HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of camptothecin standard (A)and sample (B)

3 結(jié)果與分析

3.1 喜樹堿含量測定

將標(biāo)準(zhǔn)喜樹堿溶液和分離純化后的樣品溶液上HPLC 儀器檢測，所得圖譜如下:

結(jié)果表明，喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為7.492 min(圖1A);喜樹堿濃度(mg/L)X 與峰面積(uv·s)Y 的線性回歸方程為:Y=16713X -20674，R=0.9994，表明喜樹堿在5.0～40.0 mg/L 范圍內(nèi)具有良好的線形關(guān)系;樣品(圖1B)在7.502 min 處出峰，且與其它組分達到基線分離，證明提取物中含有喜樹堿。

3.2 乙醇浸提喜樹堿單因素實驗結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對喜樹堿提取效率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比分別加入80%、85%、90%、95%、100%的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測定喜樹堿濃度，得乙醇濃度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(A)。結(jié)果表明，提高乙醇濃度有利于喜樹堿的浸出，當(dāng)乙醇濃度超過90%，得率反而降低，100%時提取效率最低，僅有0.375‰。水的存在有利于喜樹果粉末有效成分的溶出，提高乙醇濃度可增加喜樹堿提取率，在90%時達到最大值，因此選擇90 %的乙醇溶液為浸出最優(yōu)濃度。

3.2.2 液料比對喜樹堿提取的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的液料比加入90 %的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測定喜樹堿濃度，得料液比與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(B)。結(jié)果顯示，隨著提取溶劑用量的增加，喜樹堿含量也相應(yīng)提高，但增幅隨溶劑用量的增加而減緩，當(dāng)濃縮比超過1∶20 后，喜樹堿的得率保持不變，為節(jié)省溶劑及回收溶劑的能耗，選擇最佳液料比為20∶1。

3.2.3 提取溫度對喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 的液料比加入90%的乙醇，分別于20、30、40、50、60 ℃浸提2.0 h，經(jīng)純化后測定喜樹堿濃度，得提取溫度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(C)。

結(jié)果顯示，在20～40 ℃提取范圍內(nèi)，隨著溫度升高，喜樹堿得率緩慢增加，但增勢不明顯，僅為0.84%;40 ℃至60 ℃時則基本無變化，說明在40～60 ℃范圍內(nèi)，溫度對提取效率影響不顯著，因此喜樹堿乙醇提取溫度宜控制在40 ℃，后續(xù)實驗不再考查溫度因素。

3.2.4 提取時間對喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比加入90%的乙醇，40 ℃下分別浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，經(jīng)純化后測定喜樹堿濃度，得提取時間與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(D)。

由圖可知，浸提時間對喜樹堿的得率有較大影響，提取時間越長，喜樹堿得率越高?？紤]到提取時間過長將延長提取周期，且會增加喜樹堿發(fā)生氧化概率，進而降低喜樹堿提取效率，因此選擇浸提時間2.0 h 為宜。

圖2 乙醇濃度(A)、液料比(B)、溫度(C)及時間(D)對喜樹堿提取效率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration (A)，liquid:solid ratio (B)，temperature (C)and time (D)on the extraction yield of camptothecin

3.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

3.3.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果

對影響提取得率較大的液料比、乙醇濃度、提取時間3 因素作3 水平的響應(yīng)面正交設(shè)計實驗，所得結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 3 Results of RSM experiments

3.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗

對上述實驗結(jié)果進行響應(yīng)曲面分析，所得方差分析如表4 所示。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA of regresion models

利用Design-Expert 7.0 對表2 試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到生物堿提取率(Y)對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、時間(C)的二次多項回歸模型為:Y=-12.2613+0.26399A+6.795 × 10-3B +1.20095C+1.7 ×10-4AB-5.9 ×10-3AC-3.2 ×10-3BC-1.438 × 10-3A2-3.48 × 10-4B2-0.1368C2，R2=0.9998，表明擬合情況良好，回歸方程模型可行。

方差分析結(jié)果表明，各因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著:回歸模型F 值=87.72，P＜0.0001，表明二次多元回歸模型極其顯著;失擬F 值=4.72，P=0.0839＞0.05，模擬失擬不顯著;模擬的整確定系數(shù)R2=0.9998，說明該模型擬合程度比較好，實驗誤差小，適合用于對喜樹生物堿提取進行分析和預(yù)測。

圖3 3 因素交互作用對喜樹堿提取率影響的響應(yīng)面圖(B-C、A-C、A-B)Fig.3 Response surface plots showing the cross interaction among three factors (BC，AC，AB)

圖4 分別表示在固定乙醇濃度90%、液料比20∶1(mL/g)和醇提時間2.0 h 的條件下，液料比-時間(B-C)、液料比-時間(A-C)、乙醇濃度-液料比(AB)3 因素交互作用對提取率的影響。結(jié)果顯示，A、B、C 三者交互作用顯著。對回歸方程進行一階求導(dǎo)，得3 元一次方程:0.26399-0.00017B-0.0059C-0.002874A=0;0.006795-0.00017A-0.0032C-0.00696B=0;1.20095-0.0059A-0.0032B-0.2736C=0。求解方程得到最佳提取條件為:乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時間2.23 h，按照上述條件補做驗證性實驗，結(jié)果顯示喜樹堿提取率提高至0.847 mg/g(干重)，較單因素最佳提取工藝提高了3.42%，優(yōu)化效果顯著。

4 結(jié)論

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用響應(yīng)面正交實驗法對喜樹生物堿3 個影響因素進行分析，確定最佳提取工藝為乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時間2.23 h，此時喜樹生物堿提取率可達到0.847 mg/g(干重)。本研究首次采用響應(yīng)面正交實驗的方法對湖南產(chǎn)喜樹生物堿提取工藝進行了優(yōu)化。本研究為實現(xiàn)喜樹中特殊成分-喜樹堿提取效率的提高，進一步開發(fā)利用喜樹這一重要藥用植物提供了重要的實驗依據(jù)，為喜樹堿的提取工藝提供了又一科學(xué)合理，準(zhǔn)確可靠的實驗數(shù)據(jù)。

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