中藥及雷氏大疣蛛毒干預(yù)小鼠皮下移植肝腫瘤細胞后RhoA/ROCK信號通路蛋白表達的變化

陳繼新，劉天云，羅赤苗，張國華，陳嘉勤，鄭 核，賀小平(.南華大學(xué)，湖南 衡陽 00；.邵陽市第一人民醫(yī)院外科；.邵陽市中心醫(yī)院；.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院)

肝癌是由遺傳和表觀遺傳改變而發(fā)生的惡性腫瘤[1]。目前，臨床上一般采取手術(shù)、放療、化療、生物治療、中藥治療以及綜合治療等療法。手術(shù)切除和肝移植仍是肝癌治療最佳方法，但由于肝臟腫瘤惡性程度高，進展快，故臨床上就診患者約半數(shù)以上患者已為中晚期，且接受手術(shù)治療患者術(shù)后易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。對于可手術(shù)的肝癌患者，術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響治療效果及預(yù)后的主要因素，對于不能手術(shù)的中晚期肝癌患者尚缺乏有效的治療方法。因此，深入了解肝癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的治療手段對肝癌患者臨床治療有極為重要的意義。

雷氏大疣蛛毒素已被研究證實是由神經(jīng)毒性肽、蛋白質(zhì)和低分子量物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜混合物，具有多種活性[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，雷氏大疣蛛毒可以抑制人肝癌BEL-7402、HepG2細胞、宮頸癌Hela細胞的生長及增殖[4-6]。其對多種癌細胞株增殖抑制作用的機制仍未明確。中醫(yī)藥在抗擊肝癌的過程中發(fā)揮了重要的作用,從中藥中尋找有效的抗癌藥物是當(dāng)前的研究熱點之一。本實驗用的抗癌中藥由白花蛇舌草和半邊蓮等中草藥組成,具有清熱解毒、活血化瘀、提高機體免疫力等功效；對治療腫瘤則正虛邪實，扶正固本與驅(qū)邪[7]，其機制有待于進一步的研究。

RhoA(Ras homolog gene family，member A)是小分子Rho家族的一員，它在參與維持細胞形態(tài)、細胞的粘附作用及細胞周期調(diào)控中起重要作用。研究表明，RhoA在許多腫瘤中異常表達，且促進了腫瘤細胞的惡性化程度。Rho激酶(Rho associated kinase，ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，約有1300個氨基酸殘基。ROCK是RhoA重要的效應(yīng)蛋白之一，通過對肌球蛋白輕鏈的磷酸化而參與細胞聚集、黏附和纖維收縮，轉(zhuǎn)染ROCK的癌細胞可不依賴于血清而產(chǎn)生侵襲特性。本研究采用雷氏大疣蛛毒和抗癌中藥干預(yù)的手段，通過HE染色觀察腫瘤組織細胞形態(tài)觀察、免疫組織化學(xué)方法法檢測小鼠皮下移植的H22肝腫瘤組織中RhoA和ROCK等蛋白的表達，探討其在H22肝腫瘤組織中的表達和理論意義，為肝癌患者預(yù)后判斷及臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

成年健康雄性昆明(KM)小鼠，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物中心(許可證號:湘scxk2003-003)提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將30只KM小鼠隨機均分為3組：模型組，雷氏大疣蛛毒素組和中藥組，每組10只。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，室溫23～25 ℃，相對濕度40～60%；自由進食、飲水，采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料(湖南斯萊克景達實驗動物中心提供)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建 模型組，雷氏大疣蛛毒素組和中藥組小鼠均參照皮下注射法[8]構(gòu)建皮下移植瘤模型。具體操作：將濃度為1×106個/mL小鼠H22肝癌腫瘤培養(yǎng)細胞懸液，接種于8只KM小鼠后頸部皮下，接種體積為0.5 mL/只。待瘤體長至1～1.5 cm3時(15天左右),處死小鼠,選擇生長良好的瘤組織,無菌條件下制成瘤細胞懸液(約每毫升含瘤細胞2×106個),每只小鼠后頸部皮下接種0.2 mL。

1.2.2 給藥方案 雷氏大疣蜘蛛毒素由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供。臨用前取無菌生理鹽水按1∶10的比例稀釋，制成雷氏大疣蜘蛛毒素輸注液。建模成功后第三天開始尾靜脈雷氏大疣蛛毒素，雷氏大疣蛛毒素組尾靜脈注射0.3 mL，連續(xù)給藥20天。中藥方劑組成：三棱6 g、莪術(shù)6 g、赤芍6 g、鱉甲5 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g、豬苓6 g、玄胡7 g、丹參7 g、紫草根6 g、白花蛇舌草12 g、半枝蓮12 g、蒲公英12 g、大黃3 g。藥液制備：用400 mL水浸泡，加熱煮沸，文火煎煮1 h，趁熱過濾；同法再煮2次，合并3次濾液，經(jīng)恒溫水浴濃縮至100 mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。按人與小鼠體表面積折算等效劑量經(jīng)口灌胃。中藥灌胃劑量0.4 mL/次，共6周。中藥組和雷氏大疣蜘蛛毒素組小鼠于術(shù)后3天開始每天(下午6時)干預(yù)。

1.2.3 試劑 RhoA、ROCK、P21、Bad、bcl-2一抗由武漢博士德生物工程有限公司提供，即用型二抗二抗即用型SABC小鼠/兔IgG、抗體稀釋液、DAB、DAB Kit、Poly-L-Lysine、快捷免疫組化、Tween20由福州邁新生物有限公司提供。0.9%氯化鈉注射液、甲醇、無水乙醇、多聚甲醛等常用分析純試劑均購于上海化學(xué)試劑公司；10%水合氯醛購自邵陽市中心醫(yī)院。

1.2.4 樣品采集與處理 6周后各組小鼠禁食過夜，用10%的水合氯醛麻醉，頸椎脫臼處死。取出腫瘤組織并稱重，取部分新鮮腫瘤組織保存于液氮中，進行總RNA提取；另一部分置于10%多聚甲醛溶液(0.1M，pH=7.4)中固定12小時以上，石蠟包埋、組織切片，HE染色觀察及免疫組化染色分析。

1.2.5 小鼠腫瘤體積測量 H22肝癌腫瘤細胞懸液接種后，每天觀察小鼠腫瘤生長情況，自可見皮下醬黑色腫塊突起(平均第3天)起，每4天測量1次腫瘤體積。用游標(biāo)卡尺測量瘤體的最長徑(L)和最短徑(W)，按公式(V=0.5236×L×W)計算各瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線。

1.2.6 病理學(xué)觀察 取厚3 μm石蠟切片，脫蠟、脫水，蘇木素和伊紅HE染色，脫水，透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)。

1.2.7 免疫組織化學(xué)染色 采用SABC法免疫組織化學(xué)染色檢測腫瘤組織RhoA/ROCK信號通路及相關(guān)細胞因子蛋白水平的差異表達：多聚賴氨酸涂片，厚3 μm石蠟切片，高壓鍋沸騰檸檬酸熱抗原修復(fù)，一抗(1∶500)，室溫孵育1 h，PBS沖洗干凈，二抗(即用型SABC小鼠/兔IgG)，室溫孵育30 min，PBS沖洗干凈，DAB顯色5～10 min，蘇木素復(fù)染1～3 min，Olympus(日本)顯微拍照。PBS代替一抗作陰性對照。用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國)分析免疫組化陽性產(chǎn)物面積，每張切片在200倍鏡下選取不相重疊的3個代表性視野，計算每個樣本的陽性面積百分比(陽性反應(yīng)面積/測量面積)。

1.2.8 質(zhì)量控制 動物采用固定的飼養(yǎng)人員，實驗取材、指標(biāo)檢測人員固定，以消除人員異動引起的誤差。小鼠灌胃動作要輕柔，從口角進入，防止損傷食道。尾靜脈注射前要用酒精擦拭尾巴，擴充血管；選擇進針部位，遵循先遠后近原則,以抽回血方式作為針進入血管的標(biāo)志。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，用Excel軟件作圖。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用雙側(cè)t檢驗，P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般行為學(xué)觀察

模型構(gòu)建過程中，各組未發(fā)生意外死亡情況。模型構(gòu)建成功后，小鼠食欲較正常，精神狀態(tài)尚可。隨腫瘤生長，小鼠食欲下降、精神狀態(tài)逐漸變差。雷氏大疣蛛毒素組和中藥組小鼠上述癥狀均輕于模型非干預(yù)組。

2.2 小鼠腫瘤生長狀況

如表1顯示，小鼠測量數(shù)目為每組10只，腫瘤測量次數(shù)為10次，每4天測量一次。由表可見：模型對照組腫瘤體積生長速度最快，雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組最慢，中藥干預(yù)組居間。自第2次測量開始雷氏大疣蛛毒組與模型組體積出現(xiàn)差異(P<0.05)，第3、第4次測量顯示中藥組、雷氏大疣蛛毒組與模型對照組相比有非常顯著性差異(P<0.01)，且雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比出現(xiàn)差異(P<0.05)及(P<0.01)。第5次測量結(jié)果顯示：與模型對照組相比中藥組、雷氏大疣蛛毒組均有顯著性差異(P<0.05)，雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比存在顯著性差異(P<0.05)。第6、7、8、9、10次測量結(jié)果均顯示中藥組、雷氏大疣蛛毒組與模型對照組相比存在非常顯著性差異(P<0.01)，且雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比存在非常顯著性差異(P<0.01)。

表1 三組小鼠腫瘤體積10次測量結(jié)果

2.3 三組小鼠腫瘤組織HE染色形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果(圖1)顯示：模型非干預(yù)組小鼠腫瘤細胞排列緊密、規(guī)整,核質(zhì)比較大，核染色深且異型性明顯。雷氏大疣蛛毒素組小鼠:細胞排列稀疏、欠規(guī)則，可見異型細胞。腫瘤細胞核固縮，片狀空泡樣變性、壞死。壞死區(qū)面積大于低劑量組。中藥組：腫瘤細胞排列松散、無序，出現(xiàn)壞死區(qū)，胞核較小、破壞不明顯，可見少量空泡樣變性。

圖1 三組小鼠腫瘤組織病理切片HE染色圖(×200)

2.4 三組小鼠腫瘤組織RhoA、ROCK、p21免疫組化檢測

從圖2可以看出：RhoA、ROCK表達定位于細胞漿，偶見細胞膜。p21表達定位于細胞核。RhoA、ROCK表達的強弱(棕黃色陽性顆粒的散布程度)依次為模型組、抗癌中藥、雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組。p21表達的強弱(棕黃色陽性顆粒的散布程度)依次為雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組、抗癌中藥組、模型組。

表2顯示，與模型非干預(yù)組相比較，雷氏大疣蛛毒素組p21表達最高，(P<0.01)。模型組RhoA、ROCK表達均最高，抗癌中藥組、雷氏大疣蛛毒素組表達與模型組相比較顯著降低(P<0.01)。且抗癌中藥組與雷氏大疣蛛毒素組比較差異有顯著性差異(P<0.01)。

3 討 論

腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，首先要黏附于宿主細胞表面，再通過血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠處。這個過程涉及多種基因產(chǎn)物之間的相互協(xié)調(diào)作用，其中重要的是調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、移動、粘附的細胞骨架肌動蛋白[9]。RhoA是小分子G蛋白Rho家族的一員，被認為與細胞形態(tài)、運動、細胞骨架的組裝和遷移有關(guān)[10-12]。在肝癌組織中，RhoA表達量增高，并且其過量表達與肝癌的分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無靜脈浸潤以及有無肝外轉(zhuǎn)移灶有關(guān)[13-14]。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，約有1300個氨基酸殘基。RhoA蛋白激活后,與ROCK的RBD結(jié)合將ROCK激活，同時發(fā)生定向轉(zhuǎn)位與肌球蛋白輕鏈(MLC)靠近。ROCK的激活本身可以將MLC磷酸化而發(fā)生肌絲收縮作用，同時MLCP是活化ROCK的底物，在接受RhoA/ROCK的活化信號后磷酸化，從而失活，阻止了磷酸化的MLC脫磷酸失活，使得胞漿內(nèi)磷酸化MLC水平提高，肌球-肌動蛋白交聯(lián)增加，促進MLC磷酸化而促進肌絲收縮在癌細胞的遷移中起主要作用[15]。此外，有研究顯示RhoA/ROCK蛋白調(diào)節(jié)細胞周期主要涉及在G1/S轉(zhuǎn)化過程[9]。

圖2 三組小鼠腫瘤組織中RhoA、ROCK、p21免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

表2 三組小鼠免疫組織化學(xué)染色陽性表達比較(%)

本實驗中，抗癌中藥組和雷氏大疣蛛毒素組的RhoA、ROCK蛋白水平表達比模型非干預(yù)組明顯減少，提示中藥和雷氏大疣蛛毒素下調(diào)了RhoA、ROCK的含量，從而影響了RhoA/ROCK信號通路開放，從而減緩了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

細胞周期進展涉及多種細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的連續(xù)激活。p21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細胞周期抑制蛋白。p21可與幾乎每一個Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，廣泛的抑制各種Cyclin-CDK復(fù)合物，使細胞停滯在G1期而抑制細胞增殖，還能結(jié)合并抑制細胞質(zhì)中的ROCK活性。p21不同區(qū)域?qū)?yīng)于不同的靶位，其N端結(jié)合并抑制Cyclin-CDK，而C段則結(jié)合PCNA，從而覆蓋PCNA的某些功能區(qū)，使PCNA不能與DNA聚合酶D形成復(fù)合物，或使DNA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動，影響DNA復(fù)制。已有研究證明，p21的過表達可使細胞周期阻滯于G1期、G2期或S期[16]。p21與腫瘤的分化、浸潤深度、增生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，具有判斷預(yù)后的價值[17]。

抗癌中藥與雷氏大疣蛛毒素干預(yù)后，p21蛋白表達量較高，尤以雷氏大疣蛛毒素組表達最高。其作用機制可能是抗癌中藥和雷氏大疣蛛毒素提高了p21蛋白的含量，從而抑制了H22腫瘤的增殖。有研究顯示[18]雷氏大疣蛛毒素能抑制人肝癌細胞HepG2增殖的可能機制之一是使p21基因和蛋白表達增加,G2/M細胞周期被阻滯,從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗結(jié)果表明，抗癌中藥、雷氏大疣蛛毒能有效的抑制小鼠H22肝癌組織的增殖，其中雷氏大疣蛛毒素的抑制作用更為顯著。雷氏大疣蛛毒素中的活性物質(zhì)可能通過間接維持細胞內(nèi)p21的含量，從而增強了對腫瘤增殖的抑制作用。

綜上所述，抗癌中藥及雷氏大疣蛛毒素，對小鼠皮下移植的H22肝腫瘤生長和增殖有明顯的抑制作用，尤以后者效果更為顯著。其機制可能是雷氏大疣蛛毒素可能通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號通路中RhoA、ROCK和p21等相關(guān)細胞因子的表達，從而抑制了腫瘤的增殖。

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