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      大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)的克隆及序列分析

      2014-01-07 07:05:04富國文王紹卿滕曉紅榮華賈俊靜樊月圓
      家畜生態(tài)學(xué)報 2014年6期
      關(guān)鍵詞:大圍山核苷酸垂體

      富國文,王紹卿,滕曉紅,榮華,賈俊靜,樊月圓

      (云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明,650201)

      垂體特異轉(zhuǎn)錄因子(pituitary specific transcription 1,POU1F1)是動物垂體前葉特異表達的一種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子,該轉(zhuǎn)錄因子表達的產(chǎn)物通過與垂體中PRL基因、GH基因、TSH基因以及POU 1F1自身的調(diào)控元件結(jié)合,調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄,從而對動物的生長發(fā)育等起著重要的調(diào)控作用[1-2]。POU1F1由POU1F1基因編碼,是POU結(jié)構(gòu)域因子家族的一員。POU家族中成員大多具有一個POU特異區(qū)(POU-HD)和一個POU同源區(qū)(POU-SD)的DNA結(jié)合域,該結(jié)構(gòu)域能識別特異的基因序列并與之結(jié)合。從而引起細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄,促進垂體前葉促生長素細胞、催乳細胞和促甲狀腺素細胞基因的轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)活性[3]。在人上,POU1F1基因位點的突變可導(dǎo)致人類的生長發(fā)育異常,包括生長緩慢及矮小等癥狀。同時GH、PRL和TSH-β缺乏的程度依賴于POU1F1基因的突變類型;在鼠上,已研究證實該基因與矮小性狀基因座存在緊密連鎖關(guān)系[4-7]。在家禽上,POU1F1基因位點的突變與其生長性能相關(guān)性也被做了大量的研究[8-10]。

      大圍山微型雞是云南省的優(yōu)良地方品種,主要分布在云南省紅河州屏邊苗族自治縣境內(nèi)大圍山自然保護區(qū)。該雞種具有較高的屠宰率和全凈膛率,產(chǎn)蛋率高,耗料少,飼料報酬率高等優(yōu)點。但是它個體小,成為其在生產(chǎn)上的致命缺點。如果能從分子水平上找出該品種體型較小的成因,無疑對改變其生長狀況具有重要實際意義。

      1 材料與方法

      1.1 材 料

      來自云南武定縣的武定雞和大圍山的微型雞各5只。從翅下采血5 m L,于-80℃保存。

      1.2 基因組DNA制備

      血樣基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法,提取后的DNA用TE緩沖液溶解后,經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度后,-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3 PCR擴增

      引物設(shè)計:參照GeneBank中提供的雞POU1F1基因的序列(登錄號:NC_006088),利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。引物共6對,包括6個完整的外顯子區(qū)域,引物的合成及測序工作由華大基因技術(shù)有限公司完成。引物信息如下(表1)。

      表1 引物序列、產(chǎn)物大小、位置以及Tm值Table 1 The sequences of primers,length,location and Tm of each PCR product

      15μL PCR反應(yīng)體系:10×Buffer(含15 m M Mg2+)1.5μL,2 m M d NTPs 1.5μL,2 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL,5 M混合引物(上游引物和下游引物各為10 pmol/μL)0.6μL,模板DNA (50 ng/μL)1.0μL,dd H2O 10.15μL。

      PCR擴增程序:94℃預(yù)變性4min;35個循環(huán)(94℃30s,Tm 30 s,72℃30 s);72℃延伸10min,4℃保存。

      1.4 POU1F1基因PCR產(chǎn)物的回收與測序

      PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增結(jié)果,并送北京六合華大基因科技股份有限公司測序,使用軟件剪切拼接后獲得編碼區(qū)序列。

      1.5 POU1F1基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

      圖1 POU1F1基因P1~P6引物的擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of P1~P6 primers for POU1F1 geneM.DNA標準 DL2000;1,2.P1引物的擴增產(chǎn)物;3,4.P2引物的擴增產(chǎn)物;5,6.P3引物的擴增產(chǎn)物;7,8.P4引物的擴增產(chǎn)物;9,10.P5引物的擴增產(chǎn)物;11,12.P6引物的擴增產(chǎn)物M.DNA Marker DL2000;1,2.Product of P1;3,4.Product of P2;5,6.Product of P3;7,8.Product of P4;9,10.Product of P5;11,12.Product of P6

      利用DNAstar軟件包中的EditSeq、GeneQuest和Meg Align對PUO1F1基因序列、ORF進行分析;利用Protean軟件對POU1F1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進行分析預(yù)測;從NCBI下載不同物種的POU1F1基因序列,利用DNAman和DNAstar軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹及遺傳距離研究。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 POU1F1基因的PCR擴增結(jié)果

      POU1F1基因各引物均得到特異性擴增,如圖1所示。其中P1引物的擴增產(chǎn)物為1和2號樣品,擴增片段大小為245 bp;P2引物的擴增產(chǎn)物為3和4號樣品,擴增片段大小為286 bp;P3引物的擴增產(chǎn)物為5和6號樣品,擴增片段大小為318 bp;P4引物的擴增產(chǎn)物為7和8號樣品,擴增片段大小為269 bp;P5引物的擴增產(chǎn)物為9和10號樣品,擴增片段大小為208 bp;P6引物的擴增產(chǎn)物為11和12號樣品,擴增片段大小為245 bp。

      2.2 大圍山微型雞編碼區(qū)的序列分析

      利用DNAstar軟件對6對引物的測序結(jié)果與Gallus gallus(NM_204319)進行了比對,手工剪接后得到了全長編碼區(qū)序列,大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長為984 bp,武定雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長也為984 bp。與Gallus gallus(NM_204319)進行了比較,在檢測的個體中,大圍山微型雞在編碼區(qū)的836 bp處發(fā)生了一個C/T的單堿基突變,該突變未引起279位Ile變異。利用EditSeq和GeneQuest軟件,對大圍山微型雞POU1F1基因的編碼區(qū)的核苷酸組成進行分析,其中核苷酸A、C、G和T分別為287、238、229和230個。

      2.3 POU1F1基因的開放閱讀框分析

      本研究將大圍山微型雞編碼區(qū)序列通過Edit-Seq軟件進行分析,獲得了一條長456 bp的ORF(圖2),該ORF起始密碼子位于±1,終止密碼子位于±984,推測大圍山微型雞POU1F1基因可編碼1個由327個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

      圖2 大圍山微型雞POU1F1基因ORF序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and encoded amino acid sequence of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

      2.4 POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

      用Bioedit及Protean軟件對POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行預(yù)測,結(jié)果顯示,POU1F1基因編碼327個氨基酸,其中絲氨酸(Ser)和亮氨酸(Leu)所占比例最高,分別達到了12.23%和9.17%(圖3);推測該編碼產(chǎn)物在p H 7.0環(huán)境下的電荷量為9.81,理論等電點為 8.67,理論分子質(zhì)量為38801.19 Da.

      根據(jù)Protean結(jié)果,POU1F1基因的編碼產(chǎn)物的疏水性在多肽鏈第12位纈氨酸具有最低的分值(-2.14),在第250位的精氨酸具有最高的分值(3.72),且推斷整條多肽鏈氨基酸序列表現(xiàn)為親水性而沒有明顯的疏水性區(qū)域。

      2.5 大圍山微型雞與其他物種POU1F1基因核苷酸序列同源性分析

      將NCBI上不同物種的POU1F1基因核苷酸序列(牛:NM_174579,家犬:XM_005638736,山羊:NM_001285673,野鴿:XM_005511429,原雞:NM_204319,人:NM_001122757,獼猴:NM_001042860,家鼠:NM_008849,綿羊:NM_001009350,褐家鼠:NM_013008,野豬:NM_214163)與本研究所獲取的大圍山微型雞以及武定雞的POU1F1基因的核苷酸序列進行對比,利用Meg Align軟件分析了這13條核苷酸序列的同源性(表2)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明,原雞、武定雞以及大圍山微型雞與其它10個物種POU1F1基因的核苷酸相似性從23.6~26.9,親緣關(guān)系較遠。

      圖3 大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of coding DNA sequences of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

      表2 不同物種POU1F1基因的遺傳距離Table 2 The sequence distance base on the POU1F1 gene of different species

      3 討 論

      1992年,在家禽中,火雞的POU1F1基因首先被Wong等所克隆??寺〗Y(jié)果發(fā)現(xiàn),火雞的POU1F1基因與哺乳動物類似,存在三種POU1F1m RNA,分別為t POU1F1*,t POU1F1β* 和t POU1F1w*[11];Kurima等[12]1998 年 研 究發(fā)現(xiàn),三種POU1F1 m RNA中t POU1F1*表達量最高,t POU1F1β*表達量最低。Tanaka等[13]1999年從雞的垂體中克隆了編碼325和327氨基酸的兩種POU1F1m RNA,分別為c POU1F1α和c POU1F1γ。研究表明,POU1F1基因的正常表達是垂體前葉正常發(fā)育及激素正常分泌的必要條件。POU1F1基因突變可能造成人和鼠復(fù)合性垂體激素缺乏癥。姜潤澤[14]研究表明,POU 1 F 1基因第六外顯子處(299Asn→Ile)的突變與雞(尤其是公雞)早期生長速度顯著相關(guān)(P<0.05);邱峰芳等[15]研究表明,POU1F1基因與雞的1~7周齡體重極顯著相關(guān)(P<0.01),與8周齡體重顯著相關(guān)(P<0.05);陶勇等[16]在POU1F1基因型檢測到一個 A→T突變,雜合型個體體重顯著高于純合型個體。

      圖4 不同物種POU1F1基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogentic tree base on the POU1F1 gene of different species

      本研究通過對云南地方品種-大圍山微型雞的POU1F1基因6個克隆片段進行拼接后得到了大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列,該序列為包括終止密碼子在內(nèi)的完整的編碼區(qū)序列,序列長度為984 bp,編碼有327個氨基酸殘基。朱志明等[17]對半番鴨的POU1F1基因進行克隆,獲得了完整的cDNA序列,全長為2 209 bp,與雞的氨基酸序列同源性達到了96.3%。本研究對牛、家犬、山羊、野鴿、原雞、人、獼猴、家鼠、綿羊、褐家鼠、野豬、大圍山微型雞和武定雞的核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),家禽與哺乳動物有較遠的親緣關(guān)系,核苷酸相似性從23.6~26.9,這與家禽POU1F1序列的特殊性有關(guān)。對于家禽而言,禽類POU1F1存在一個由38個氨基酸組成的肽段,該肽段是禽類所特有的,位于相當于哺乳動物外顯子2、3之間,將其命名為外顯子2a。從遺傳距離分析及基因系統(tǒng)進化樹,我們也發(fā)現(xiàn),親緣關(guān)系較近先聚在一起,如:牛、山羊及綿羊最先聚在一起,核苷酸相似性達到97.6%以上,聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)基本相符。同時在原雞、武定雞以及大圍山微型雞的POU1F1基因編碼區(qū)序列比對中,在大圍山微型雞的836bp處發(fā)生了一個C/T的單堿基突變,雖然在核苷酸水平上有一些差異,但屬于同義突變,并不影響編碼蛋白的結(jié)構(gòu)組成。

      本研究所獲得的大圍山微型雞的完整的POU1F1編碼區(qū)序列,為以后研究POU1F1基因與大圍山微型雞經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ),也為研究大圍山微型雞體型矮小的分子機理奠定了基礎(chǔ),下一步研究將在增大樣本量后,從多個角度全面地揭示其遺傳特性。

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