牦牛、犏牛、藏黃牛和普通牛HIOMT基因CDS序列的比較

張 云，澤讓東科，艾 鹥，王 永，文勇立＊

（1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，四川 成都610041）

生物節(jié)律是生命活動(dòng)的基本特征，具有內(nèi)源性、遺傳性、環(huán)境適應(yīng)性等性質(zhì)。褪黑激素（Melatonin，MLT）主要由松果體組織分泌，是調(diào)控晝夜節(jié)律、生殖節(jié)律等多種生物節(jié)律，且具有復(fù)雜生理功能的一種吲哚類(lèi)激素［1］。外界光節(jié)律信息被編碼到MLT信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)，在MLT靶組織中獲得解碼，從而調(diào)控如季節(jié)性生殖等節(jié)律性生命活動(dòng)［2］。MLT的合成分別由4種酶按先后步驟進(jìn)行的，其中，后兩步酶分別為五羥色胺-氮-乙酰轉(zhuǎn)移酶（arylalkylamine-N-acetyltransferase，AANAT）和羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移 酶 （hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）是MLT合成的兩種主要酶。研究表明，這兩種酶的活性及基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的節(jié)律性共同決定了MLT分泌的波動(dòng)模式，從而完成對(duì)復(fù)雜生物節(jié)律的調(diào)控［3-10］。據(jù)文獻(xiàn)，HIOMT基因的功能和結(jié)構(gòu)比AANAT更為復(fù)雜，同時(shí)報(bào)道相對(duì)較少，對(duì)小鼠和雞松果體的研究表明，松果體是機(jī)體唯一有HIOMT酶存在的器官，且其活性在夜間比白天高10%～20%，與褪黑激素合成波動(dòng)性呈正相關(guān)［11-14］。此外，過(guò)去的研究絕大多數(shù)以小鼠等小型動(dòng)物為對(duì)象，而鮮見(jiàn)對(duì)大型哺乳類(lèi)動(dòng)物的相關(guān)研究。自然條件下，牦牛的生殖對(duì)策表現(xiàn)出很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，除繁殖活動(dòng)具有明顯的季節(jié)性（7～9月發(fā)情，次年4～6月產(chǎn)犢）外，成年母牦牛還呈現(xiàn)1年或2年的產(chǎn)犢節(jié)律性。據(jù)調(diào)查，在青藏高原許多地區(qū)約30%的成年雌體可每年產(chǎn)1胎，而70%左右的成年雌體表現(xiàn)為隔1年產(chǎn)1胎。牦牛血漿MLT分泌同其他季節(jié)性繁殖動(dòng)物一樣具有近日節(jié)律［15］，提示開(kāi)展牦牛MLT合成酶基因相關(guān)研究是深入了解MLT生殖調(diào)控機(jī)制的重要線索。本研究采用RT-PCR方法克隆并分析了牦牛、藏黃牛和犏牛褪黑激素合成酶HIOMT基因CDS序列，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究牦牛乃至哺乳動(dòng)物繁殖周期等生物節(jié)律調(diào)控機(jī)制積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣國(guó)中食品有限公司，隨機(jī)選取健康、發(fā)育良好的成年雄性牦牛、藏黃牛和犏牛各1頭，宰殺后立即取出松果體，液氮保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

1.2.1 CDS序列引物 根據(jù)普通牛HIOMT基因mRNA 序 列 （Genbank Accession Number M81862）設(shè) 計(jì) 同 源 性 引 物：HIOMT-F1（5＇-TAGACTGGTGAAGCCCAAAGC-3＇）和 HIOMTR1（5＇-GACCATCCGTGG GCATAAAC-3＇），由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 DNA序列引物 為了獲得基因組中HIOMT基因的DNA片斷（用于驗(yàn)證下述牦牛HIOMT基因CDS缺失序列是否存在于基因組），通過(guò)http：／／genome.ucsc.edu／數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得知普通牛HIOMT基因位于chr Un＿JH125805，在其中35541-34838位點(diǎn)處設(shè)計(jì)同源性引物HIOMT-F2（5＇-ATTGAGGCAGGCTGACAAGG-3＇）和 HIOMT-R2（5＇-CCCACGACGAAGATGGAAGA-3＇），由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 RNA、DNA 提取與 RT-PCR TRIzol（Invitrogen）提取總RNA，采用Ta KaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；DNA提取采用經(jīng)典酚／氯仿抽提法。PCR總體系25μL，其中2×Master Mix Taq 12.5 μL，cDNA 2μL，上下游引物各1μL，dd H2O 8.5 μL。cDNA擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)熱3 min；94℃變性45 s，56.8℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，持續(xù)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min后4℃保存。DNA擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)熱3 min；94℃變性45 s，52.4℃退火1 min，72℃延伸1 min，持續(xù)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min后4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）測(cè)序。

1.4 外顯子分析

將克隆所得牦牛、藏黃牛、犏牛和下載的普通牛HIOMT 基因 CDS序列于 http：／／genome.ucsc.edu／數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，獲得該基因外顯子相關(guān)信息。

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1.5 生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果由Clustal X軟件進(jìn)行排序［16］，并手工調(diào)校。采用MEGA 4.0分析核苷酸和氨基酸變異位點(diǎn)［17］，ExPASy的 ProtParam 工具分析 HIOMT編碼氨基酸基本性質(zhì) （http：／／web.expasy.org／protparam／），Compute p I／Mw分析其理論等電點(diǎn)和相對(duì)分子量（http：／／web.expasy.org／compute＿pi／），ProtScale計(jì)算其疏水性圖譜（http：／／web.expasy.org／protscale／）。采用 TMPRED 軟件分析跨膜結(jié)構(gòu) （http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html），通過(guò) HNN 在線預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（http：／／npsa-pbil.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿h(yuǎn)nn.html），SWISS-MODEL 預(yù) 測(cè) 蛋 白 三 級(jí) 結(jié)構(gòu)［18］?；贙imura雙參數(shù)法使用 MEGA 4.0構(gòu)建其N(xiāo)J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

牦牛、藏黃牛和犏牛的HIOMT基因CDS序列PCR擴(kuò)增條帶明顯，均位于1 000-1 500 bp之間，與預(yù)測(cè)1 286 bp基本吻合。藏黃牛條帶略大于牦牛，犏牛有2條帶，其中1條長(zhǎng)帶與藏黃牛相似，另1條短帶與牦牛相似（圖1）。將牦牛和藏黃牛PCR產(chǎn)物純化，同時(shí)將犏牛的長(zhǎng)、短帶分別切膠回收純化后測(cè)序。對(duì)牦牛、藏黃牛HIOMT基因DNA序列的部分序列擴(kuò)增，所得條帶明顯，位于700 bp左右，與預(yù)測(cè)704 bp基本一致（圖2），產(chǎn)物經(jīng)回收后測(cè)序。

2.2 序列比對(duì)

雙向測(cè)序分析表明，牦牛HIOMT基因和犏牛的短帶CDS序列均為915 bp，長(zhǎng)帶均為1 038 bp。與普通牛比較，藏黃牛和犏牛長(zhǎng)帶CDS序列長(zhǎng)度與其一致，而牦牛和犏牛短帶CDS序列連續(xù)缺失123 bp，并為3的倍數(shù)。藏黃牛與普通牛共存在10個(gè)變異位點(diǎn)，其中2處位于密碼子第1位（643：G→T，862：A→G），另2處位于密碼子第2位（320：T→A，965：G→C）；犏牛長(zhǎng)帶與普通牛比對(duì)共存在17個(gè)變異位點(diǎn)，其中2處位于密碼子第1位（28：A→C，862：A→G），另5處位于密碼子第2位（155：A→G，287：G→A，716：A→C，788：C→G，965：G→C）；犏牛短帶與普通牛比較，除連續(xù)缺失123 bp外，還存在13個(gè)變異位點(diǎn)，其中2處位于密碼子第1位（28：A→C，862：A→G），另4處位于密碼子第2位（155：A→G，287：G→A，503：G→A，965：G→C）；牦牛與普通牛比較，除連續(xù)缺失123bp外，還存在11個(gè)變異位點(diǎn)，其中2處位于密碼子第1位（28：A→C，862：A→G），另2處位于密碼子第2位（155：A→G，965：G→C）（見(jiàn)表1）。

圖1 牦牛、藏黃牛和犏牛HIOMT基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DNA marker 100bp ladder；1.藏黃牛；2.牦牛；3.犏牛Fig.1 PCR amplification of HIOMT in yak，Tibetan-cattle and cattle-yakM.DNA marker 100bp ladder；1.Tibetan cattle；2.Yak；3.Cattle-yak

2.3 HIOMT的外顯子分析

圖2 基因組HIOMT基因DNA片斷擴(kuò)增結(jié)果M.DNA Marker 100 bp ladder；1.牦牛；2.藏黃牛Fig.2 PCR amplification segment of the partly HIOMT gene M.DNA Marker 100bp ladder；1.Yak；2.Tibetan cattle

藏黃牛、犏牛長(zhǎng)序列和普通牛共有7處與chr Un＿JH125805序列一致，因此推測(cè)該基因共有7個(gè)外顯子，第1-7外顯子分別依次位于1～69、70～244、371～443、444～562、563～703、704～826和827～1038位點(diǎn)處；而牦牛和犏牛該基因的短序列共有6處與chr Un＿JH125805序列一致，因此推測(cè)存在6個(gè)外顯子，分別依次位于1～69、70～244、371～443、444～562、563～703和704～915位點(diǎn)處，且最后1個(gè)外顯子（704～915）與藏黃牛、犏牛長(zhǎng)序列和普通牛的第7外顯子位置（827-1038）相符，而所缺失的123 bp與藏黃牛及犏牛的長(zhǎng)序列和普通牛序列的第6外顯子（704-826）相符，因此推測(cè)，牦牛、犏牛的短序列缺失了第6外顯子。

表1 牦牛、犏牛、藏黃牛和普通牛HIOMT基因CDS序列變異位點(diǎn)分析Table 1 Variation analysis of CDS of HIOMT between yak，cattle-yak，Tibetan-cattle and cattle

表2 牦牛、犏牛、藏黃牛和普通牛HIOMT基因編碼氨基酸變異位點(diǎn)分析Table 2 Amino acid sequences substitute between yak，cattle-yak，Tibetan-cattle and cattle

圖3 普通?；蚪Mchr Un＿JH125805序列（35541-34838）與牦牛、藏黃牛比對(duì)劃線部分為牦牛和犏牛的缺失序列Fig.3 Alignment of cattle genome chr Un＿JH125805（35541-34838）with yak and Tibetan-cattleThe sequences with underline indicate the deletion of yak and cattle-yak

2.4 基因組中HIOMT基因?qū)?yīng)缺失CDS片斷的克隆

為了驗(yàn)證牦牛、犏牛短序列缺失的123 bp是否存在于基因組，將克隆測(cè)序的牦牛（699 bp）、藏黃牛（702 bp）DNA 序列與普通牛基因組chr Un＿JH125805序列35541-34838區(qū)段（704 bp）比對(duì)，顯示除少數(shù)核苷酸缺失和變異外，序列基本一致，表明牦牛、犏牛短序列HIOMT基因CDS序列的缺失并非來(lái)源于基因組缺失（圖3）。

2.5 HIOMT基因的氨基酸編碼、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)和疏水性圖譜

HIOMT基因的氨基酸編碼、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)pI、GRAVE（Grand average of hydropathicity）值均見(jiàn)表3，可見(jiàn)由突變引起的氨基酸變異造成了這些基本屬性的一定變化。結(jié)合疏水性示意圖（圖略）和GRAVE值預(yù)測(cè)該蛋白均為親水性蛋白。

表3 HIOMT基因氨基酸編碼Table 3 Amino acid composition coding by HIOMT

2.6 HIOMT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)跨膜方向由內(nèi)向外和由外向內(nèi)兩組值，均存在2個(gè)具有較高可能性的由內(nèi)向外的跨膜區(qū)，除犏牛短序列僅2個(gè)由外向內(nèi)的跨膜區(qū)外，其余均存在3個(gè)由外向內(nèi)的跨膜區(qū)（圖略）。

圖4 HIOMT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)a.牦牛；b.犏牛（短序列）；c.犏牛（長(zhǎng)序列）；d.藏黃牛；e.普通牛；藍(lán)色表示α螺旋；紅色表示β折疊；粉色表示無(wú)規(guī)則卷曲Fig.4 Secondary structure prediction of HIOMTa.Yak；b.Cattle-yak-S；c.Cattle-yak-L；d.Tibetan cattle；e.Cattle；Blue region stands forα-helix；Red region is forβ-sheet，pink region random coils

牦牛、犏牛短序列HIOMT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由304個(gè)氨基酸組成，而犏牛長(zhǎng)序列、藏黃牛和普通牛由365個(gè)氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)存在一定的差異（圖4）。其中牦牛HIOMT存在15處α螺旋區(qū)域（50.33%），11處β折疊區(qū)域（12.50%）和20處無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域（37.17%）；而普通牛則存在16處α螺旋 富 集 區(qū) 域 （53.62%），10 處 β 折 疊 區(qū) 域（11.30%）和20處無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域（35.07%），且牦牛氨基酸缺失區(qū)域位于α螺旋區(qū)域。

由SWISS-MODEL預(yù)測(cè)的牦牛、犏牛短帶、犏牛長(zhǎng)帶、藏黃牛和普通牛HIOMT蛋白空間結(jié)構(gòu)（圖5），表明牦牛和犏牛短帶間，犏牛長(zhǎng)帶、藏黃牛和普通牛間該基因核苷酸序列的變異所引起的編碼氨基酸序列的差異，對(duì)該蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響不大，但是牦牛和犏牛短大面積的堿基缺失使該蛋白的預(yù)測(cè)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的改變，這些改變可能會(huì)改變其活性甚至生物學(xué)功能。

圖5 HIOMT蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（紅色區(qū)域表明結(jié)構(gòu)不一致部分）A.牦牛；B.犏牛（短序列）；C.犏牛（長(zhǎng)序列）；D.藏黃牛；E.普通牛Fig.5 Spatial structure prediction of HIOMT （Red region indicates the different structure）A.Yak；B.Cattle-yak-S；C.Cattle-yak-L；D.Tibetan cattle；E.Cattle

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由牦牛、犏牛、藏黃牛、普通牛、山羊、綿羊、雙峰駝、羊駝、白犀牛、小耳大嬰猴和普通狨HIOMT基因CDS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖6。各節(jié)點(diǎn)自舉值均大于80，且總共分為4大分支。首先犏牛與牦牛聚為一類(lèi)，再與同屬牛亞科的藏黃牛和普通牛聚為一類(lèi)，最后于同屬牛科的羊亞科山羊、綿羊聚為一類(lèi)；駱駝屬的雙峰駝和羊駝聚為一類(lèi)；犀科的白犀牛單獨(dú)聚為一類(lèi)；靈長(zhǎng)類(lèi)的小耳大嬰猴和普通狨聚為一類(lèi)。4大分支親緣關(guān)系由近及遠(yuǎn)分別為牛科、駱駝屬、犀科、靈長(zhǎng)類(lèi)。

圖6 牦牛HIOMT基因與其他哺乳動(dòng)物構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 NJ tree between yak and other mammals based on HIOMT

3 討 論

本研究克隆了牦牛、藏黃牛和犏牛HIOMT基因CDS序列，對(duì)比發(fā)現(xiàn)藏黃牛HIOMT序列全長(zhǎng)1 038 bp，牦牛915 bp，后者連續(xù)缺失123 bp，而犏牛兼有藏黃牛1 038 bp和牦牛915 bp兩條序列。進(jìn)一步分析表明，牦牛缺失的123 bp序列并非來(lái)源于基因組，此外，基于普通牛HIOMT基因的外顯子分析表明，該缺失片段屬第7外顯子區(qū)段，由此判斷，牦牛915 bp的序列缺失第6外顯子，可能是HIOMT基因的一個(gè)可變剪接體。此結(jié)果暗示，牦牛極有可能還存在其他可變剪接體。據(jù)報(bào)道，80%的可變剪接發(fā)生在5′UTR區(qū)，19%在3′UTR區(qū)，僅1%發(fā)生在CDS區(qū)域［19］，而本研究所發(fā)現(xiàn)的缺失片斷位于CDS區(qū)域，因此，屬于一種低概率變異現(xiàn)象，有必要在后續(xù)研究中，對(duì)這些變異體進(jìn)行不同載體表達(dá)和酶活檢測(cè)，研究其與生物周期調(diào)控是否存在相關(guān)性，對(duì)于闡明生物節(jié)律機(jī)制具有重要意義。

藏黃牛與普通牛雖為同一物種，但其HIOMT基因核苷酸序列仍然存在10個(gè)變異位點(diǎn)，且4處為非同義突變，這將導(dǎo)致編碼氨基酸序列的改變，該現(xiàn)象是否與藏黃牛長(zhǎng)期生存于高海拔、寒冷、強(qiáng)紫外線照射等惡劣環(huán)境有關(guān)［20］，尚待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)犏牛HIOMT基因存在1 038 bp和915 bp兩條CDS序列，雖然分別與牦牛和藏黃牛（包括普通牛）序列一致，并且，犏牛染色體50%來(lái)自公黃牛、50%來(lái)自母牦牛，但還是不能確定兩條序列的來(lái)源。如果長(zhǎng)、短變異體現(xiàn)象均存在于黃牛和牦牛，且可能性相同，則犏牛的兩條序列中的任何1條都可能來(lái)自父本或來(lái)自母本；如果短變異體現(xiàn)象僅存在于牦牛，或存在于牦牛的可能性高于黃牛，則判斷犏牛的長(zhǎng)序列來(lái)自父本黃牛，短序列來(lái)自母本牦牛的正確性就較大，對(duì)此尚需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是牦牛、藏黃牛、普通牛還是犏牛，其HIOMT基因的核苷酸序列突變位點(diǎn)均較少，且突變主要集中在密碼子第3位，基本為同義突變，表明該基因較為保守。但是，也存在較少突變位點(diǎn)密碼子位于第1、2位的現(xiàn)象，并發(fā)生了編碼氨基酸序列的改變，從而可能改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，影響生物學(xué)功能。因此，有必要對(duì)這些非同義突變與牦牛生殖節(jié)律是否存在相關(guān)性開(kāi)展研究，以便建立其分子標(biāo)記，有助于牦牛繁殖性狀的輔助選擇［21］。

牦牛與普通牛氨基酸序列比較，除缺失部分外，還共存在4個(gè)變異位點(diǎn)，分別發(fā)生在第10、52、288和322位，這些變異導(dǎo)致預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定改變，對(duì)此需要進(jìn)一步驗(yàn)證，并研究這種改變對(duì)蛋白活性的影響［22］，將有助于闡明牦牛繁殖節(jié)律的分子調(diào)控機(jī)制。

本試驗(yàn)所獲得的牦牛HIOMT基因編碼氨基酸序列、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、疏水性、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)和糖基化位點(diǎn)等結(jié)果，將有助于對(duì)牦牛HIOMT蛋白開(kāi)展深入研究，為闡釋該蛋白對(duì)牦牛繁殖及環(huán)境適應(yīng)性影響的生理機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

由牦牛和其他哺乳動(dòng)物HIOMT基因CDS序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹(shù)能夠較準(zhǔn)確地反映物種之間的親緣關(guān)系，表明將HIOMT基因用于哺乳動(dòng)物科、屬和種間的分子進(jìn)化研究，具有一定意義。

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