南極假絲酵母脂肪酶B的克隆、表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化

（浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州 310014）

南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)可催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及聚合等反應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、日化、紡織等領(lǐng)域[1-3]。CALB在水相、有機(jī)相中具有催化活性高，穩(wěn)定性、立體選擇性好及催化底物譜廣等多種優(yōu)勢(shì)，無(wú)論是在酶學(xué)理論研究還是在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，都受到廣泛的關(guān)注[4-5]。自1995年以來(lái)，CALB已實(shí)現(xiàn)了在不同宿主中的克隆表達(dá)，如：大腸桿菌(Escherichia coli)[6]、米曲霉(Aspergillus oryzae)[7]、畢赤酵母(P.pastoris)[8]和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[9]等。CALB的克隆、表達(dá)為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。對(duì)于CALB研究已廣泛展開(kāi)，對(duì)其結(jié)構(gòu)測(cè)定[10-13]、固定化方法[14-16]及催化應(yīng)用[17-19]等都已有了一定的研究，但對(duì)其畢赤酵母工程菌的發(fā)酵條件優(yōu)化研究較少，探索最優(yōu)發(fā)酵條件具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

本課題組從實(shí)驗(yàn)室保藏的原始菌株C.antarctica ZJB09193出發(fā)，利用RT-PCR技術(shù)克隆CALB基因，并實(shí)現(xiàn)其在真核宿主菌P.pastoris中的高效表達(dá)。以該重組畢赤酵母為研究對(duì)象，以獲得高產(chǎn)CALB為目標(biāo)，進(jìn)行15 L發(fā)酵罐的發(fā)酵條件優(yōu)化，主要包括通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、初始pH、接種量及誘導(dǎo)劑量的優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

南極假絲酵母 (C.antarctica ZJB09193)為本實(shí)驗(yàn)室保存，該菌株現(xiàn)保藏于武漢普通培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCC M 2010263；大腸桿菌(E.coli JM109)和畢赤酵母(P.pastoris X-33)均為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T vector購(gòu)自TaKaRa公司，畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA為Promega公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

限制性?xún)?nèi)切酶 XhoI、XbaI、SacI、T4 DNA 連接酶購(gòu)自 Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自上海申能博彩公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司。

1.1.3 引物

引物 1：序列為 5’-ATATTACCTAGTGGTTCCGACCCTGC-3’，引物 2：Oligo(dT)18，根據(jù) mRNA 3’末端結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物 3：5’-AATCTCGAGTTACCTAGTGGTTCCGACC-3’；引物 4：5’-AGGTCTAGAAGGAGTAACAATTCCTGAAC-3’，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。固體培養(yǎng)基添加2.0%瓊脂。

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，l M 磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）100 mL，酵母氮基3.4，硫酸銨10。上述培養(yǎng)基配好后，滅菌，冷卻至室溫，每升加 2 mL 500×生物素，10.4 mL 96×組氨酸。

BMGY培養(yǎng)基配方是在BMGY培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1%甘油（v/v）。

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(g/L)：磷酸 186.9 mL，硫酸鈣0.93，硫酸鉀 18.2，硫酸鎂 14.9，氫氧化鉀 4.13，甘油 40，pH 5.5。

流加培養(yǎng)基(g/L）：硫酸銅6.0，碘化鈉0.08，硫酸錳 3.0，鉬酸鈉 0.2，硼酸 0.02，氯化鈷 0.5，氯化鋅20.0，硫酸亞鐵65，生物素0.2，硫酸5 mL/L。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPICZαA-CALB的構(gòu)建

從C.antarctica ZJB09193中提取總RNA為模板，Oligo(dT)18為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一條鏈。用cDNA第一條鏈混合物為模板，利用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，56℃退火1 min，72℃延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，利用Taq DNA聚合酶為目的基因兩端加堿基A后與pMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆載體pMD18-T-CALB。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)藍(lán)白篩選挑取白色克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物3、引物4。

以pMD18-T-CALB為模板，利用引物3、引物4擴(kuò)增CALB的結(jié)構(gòu)基因，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和XhoI消化后與酵母表達(dá)載體pPICZαA連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPICZα A-CALB。將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌E.coli JM109中，涂布于含100 μg/μL Zeocin的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定構(gòu)建的重組載體pPICZαA-CALB。重組質(zhì)粒分別被XbaI和XhoI酶切后得到4500 bp大小的片段，被XbaI和XhoI雙酶切獲得兩條分別為1000 bp和3500 bp大小的片段，它們分別與目的基因和重組載體大小一致，初步證明目的基因已成功插入載體pPICZαA中。提取經(jīng)鑒定連接正確的表達(dá)載體pPICZαA-CALB，利用SacI進(jìn)行線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 X-33中，涂布于含 100μg/μL Zeocin的YPDS平板。28℃培養(yǎng)，三天后可見(jiàn)平板上有白色，圓狀凸起的菌落。

1.2.2 重組脂肪酶的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

（一）搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)

挑取單菌落，接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，于 28℃、200 rpm 培養(yǎng) 24 h。4℃，8000 rpm 離心10 min，收集菌體。用25 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，將菌懸液轉(zhuǎn)移至500 mL的搖瓶中，28℃，200 rpm繼續(xù)培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度約為1.0%，3次/天，誘導(dǎo)培養(yǎng)3天。4℃、8000 rpm離心15 min，回收上清。取 10 μL上清液，加入等體積的 2×上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min用于SDS-PAGE分析。

（二）上罐發(fā)酵生產(chǎn)

（1）種子液的制備

挑取P.pastoris X-33/pPICZaA-CALB的單菌落接種至種子培養(yǎng)基BMGY中，28℃，200 rpm搖床培養(yǎng)24 h。在無(wú)菌條件下將種子液移入滅菌的離心杯中，4℃，8000 rpm離心10 min，棄上清，用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基重懸菌體，按10%接種量接種于含5.5 L基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中，600 rpm，28℃培養(yǎng)。

（2）流加培養(yǎng)液的補(bǔ)料

接種后，菌種會(huì)消耗基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中的甘油，經(jīng)過(guò)一段適應(yīng)期后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。在這一過(guò)程中，罐體的溶氧下降，當(dāng)甘油消耗完畢溶氧上升，此時(shí)流加50%甘油，流速約為1.65 mL/min，時(shí)間為6h，同時(shí)溶氧改用純氧和空氣混合控制，空氣和氧氣分別有流量計(jì)，在后續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量、氧氣的流量或轉(zhuǎn)速使DO控制在30%-60%。在此期間pH通過(guò)流加25%氨水和30%磷酸控制在5左右。

（3）CALB的誘導(dǎo)表達(dá)—誘導(dǎo)培養(yǎng)基的流加

流加50%甘油結(jié)束后，待溶氧再一次上升時(shí)，流加2376 mL純甲醇和99 mL流加培養(yǎng)基的混合液，流速約為0.55 mL/min。誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，4℃、12000 rpm離心5 min，收集發(fā)酵上清。

1.2.3 生物量的測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液，12000 rpm離心5 min收集菌體，90℃烘干至恒重，即為發(fā)酵液的生物量，以g/L計(jì)。

1.2.4 脂肪酶酶活的測(cè)定方法

以對(duì)硝基苯乙酸酯(p-nitrophenyl acetate,p-NPA)為底物，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定脂肪酶的活性。反應(yīng)體系如下：900 μL 20 mM Tris-HCl緩沖液，50 μL 10 mM p-NPA 乙腈溶液，50μL 酶液，30℃反應(yīng)2 min(此時(shí)處于反應(yīng)初速度時(shí)間范圍內(nèi))。測(cè)定反應(yīng)液在405 nm處的吸光值變化。

酶活單位(U)：在 30℃，pH 8.0 條件下，1 min內(nèi)催化生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組脂肪酶的構(gòu)建及表達(dá)

從C.antarctica ZJB09193總RNA中成功獲得0.8 kp的DNA片段，從經(jīng)過(guò)測(cè)序及DNAMEN軟件分析序列驗(yàn)證，該片段是南極假絲酵母脂肪酶B基因。將其成功克隆、構(gòu)建了表達(dá)載體pPICZαA-CALB，如圖1所示。根據(jù)對(duì)重組畢赤酵母鑒定的結(jié)果，將含有CALB基因的轉(zhuǎn)化子接種至BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，再轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，間隔一定的時(shí)間取樣，利用SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵液中的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2。在加入甲醇誘導(dǎo)后，目標(biāo)蛋白表達(dá)成功，在誘導(dǎo)前期，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，南極假絲酵母脂肪酶B的表達(dá)量也逐漸變多。

圖1 表達(dá)載體pPICZαA-CALB的構(gòu)建

圖2 搖瓶發(fā)酵上清液的SDS-PAGE

2.2 重組脂肪酶的上罐條件優(yōu)化

2.2.1 通氣量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH調(diào)至5.5，分別以 8 L/min，10 L/min，12 L/min 的通氣量進(jìn)行發(fā)酵，通過(guò)攪拌速度，罐壓，補(bǔ)料速度等控制DO在20%以上，發(fā)酵72 h。其結(jié)果如圖3所示。由圖可知，當(dāng)通氣量為8 L/min時(shí)，酶活最低；當(dāng)通氣量為10 L/min時(shí)，酶活最高為4.8 U/mL，繼續(xù)增大通氣量，基本不會(huì)提高酶活，但是過(guò)大的通氣量在發(fā)酵后期會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，不易控制且增大污染的機(jī)會(huì)，所以選擇通氣量為10 L/min。

圖3 通氣量對(duì)南極假絲酵母產(chǎn)脂肪酶的影響

2.2.2 攪拌速率對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH調(diào)至5.5，初始通氣量為10 L/min，控制DO在20%以上，發(fā)酵72 h考察攪拌速率對(duì)產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖4。從圖中可以可出以800 r/min為宜，過(guò)大或過(guò)小的攪拌速率酶活均有不同程度的下降，攪拌速率適當(dāng)提高可以使酶活最高峰提前。

圖4 攪拌速率對(duì)南極假絲酵母產(chǎn)脂肪酶的影響

2.2.3 接種量對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH調(diào)至5.5，攪拌速度為800 r/min，通氣量為10 L/min，選擇不同的接種量，控制DO在20%以上，發(fā)酵72 h后，測(cè)定脂肪酶活力。結(jié)果如表1所示。從表中可以看出，以10%接種量為最佳。

表1 接種量對(duì)酶活力的影響

2.2.4 初始pH對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響

控制初始攪拌速度是800 r/min，通氣量為10 L/min，接種量為10%，控制不同初始pH，發(fā)酵72 h后，測(cè)定脂肪酶活力。結(jié)果如表2所示。從表中可以看出菌體的產(chǎn)酶是在一個(gè)偏酸性的條件下，5.5為最佳，過(guò)低的pH不利于菌體的生長(zhǎng)并會(huì)抑制酶的活性。

表2 初始pH對(duì)酶活力的影響

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)酶的影響

通過(guò)上述的實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵罐操作參數(shù)如下：初始pH 5.5，接種量為10%，通氣量為10 L/min,攪拌速度是800 r/min，作發(fā)酵過(guò)程中生物量與酶活力隨時(shí)間變化曲線，如圖5所示。從圖中可以看出在5.5 L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在誘導(dǎo)劑為3500 mL左右，菌體及酶活菌達(dá)到最高，酶活最高值為5.4 U/mL。

圖5 重組脂肪酶的生長(zhǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

3 結(jié)論

從Candida antarctica ZJB09193菌株中成功克隆南極假絲酵母脂肪酶B基因，構(gòu)建的表達(dá)載體pPICZαA-CALB線性化后導(dǎo)入表達(dá)宿主畢赤酵母X-33中，經(jīng)甲醇（終濃度約為1.0%）誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)CALB功能性表達(dá)。本文還研究了在15 L發(fā)酵罐中，重組菌P.pastoris X-33/pPICZαA-CALB的發(fā)酵條件優(yōu)化，最終確定通氣量10 L/min，攪拌速度為800 r/min，初始pH 5.5，接種量10%，誘導(dǎo)劑量3500 mL可以達(dá)到較好的產(chǎn)酶量。確定DO為發(fā)酵控制的一個(gè)重要指標(biāo)，DO大于20%可確保發(fā)酵和產(chǎn)酶正常進(jìn)行。本研究為重組南極假絲酵母脂肪酶B的放大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

[1]Kramer M,Cruz JC,Pfromm PH,Rezac ME and Czermak P.Enantioselective transesterification by Candida antarctica lipase B immobilized on fumed silica[J].J Biotechnol,2010,150(1):80-86.

[2]Kim HS,Quang ATL and Kim YH.Development of thermostable lipase B from Candida antarctica(CalB)through in silico design employing B-factor and RosettaDesign[J].Enzyme Microb Tech,2010,47(1-2):1-5.

[3]Yin CH,Liu T and Tan TW.Synthesis of vitamin A esters by immobilizedCandidasplipaseinorganicmedia[J].ChineseJChem Eng,2006,14(1):81-86.

[4]Tamayo JJ,Ladero M,Santos VE and Garcia-Ochoa F.Esterification of benzoic acid and glycerol to alpha-monobenzoate glycerol in solventless media using an industrial free Candida antarctica lipase B[J].Process Biochem,2012,47(2):243-250.

[5]Jacobsen EE,Hoff BH,Moen AR and Anthonsen T.Enantioselective enzymatic preparation of chiral glutaric monocarboxylic acids and amides[J].J Mol Catal B-Enzym,2003,21(1-2):55-58.

[6]Park CG,Kim TW,Oh IS,Song JK and Kim DM.Expression of Functional Candida antarctica Lipase B in a Cell-Free Protein Synthesis System Derived from Escherichia coli[J].Biotechnol Progr,2009,25(2):589-593.

[7]Hoegh I,Patkar S,Halkier T,et al.2 Lipases from Candida antarctica-Cloning and Expression in Aspergillus-Oryzae[J].Can J Bot 1995,73（S1）:S869-S875.

[8]Rotticci-Mulder JC,Gustavsson M,Holmquist M,et al.Expression in Pichia pastoris of Candida Antarctica lipase B and li pase B fused to a cellulose-binding domain[J].Protein Expres Purif 2001,21（3）:386-392.

[9]Han SY,Pan ZY,Huang DF,et al.Highly efficient synthesis of ethyl hexanoate catalyzed by CALB-displaying Saccharomyces cerevisiae whole-cells in non-aqueous phase[J].J Mol Catal BEnzym 2009,59（1）:168-172.

[10]Uppenberg J,Hansen MT,Patkarr S and Jones TA.The Sequence,crystal-tructure determination and refinement of 2 crystal forms of lipase-B from Candida antarctica[J].Structure,1994,2(5):453-454.

[11]Uppenberg J,Hansen MT,Patkar S and Jones TA.Sequence,Crystal-Structure Determination and Refinement of 2 Crystal Forms of Lipase-B from Candida-Antarctica[J].Structure,1994,2(4):293-308.

[12]Uppenberg J,Patkar S,Bergfors T and Jones TA.Crystallization and preliminary-X-Ray studies of lipase-B from Candida antarctica[J].J Mol Biol,1994,235(2):790-792.

[13]Martinelle M and Hult K.Kinetics of acyl transfer-reactions in organic media catalyzed by Candida antarctica lipase-B[J].Bba-Protein Struct M,1995,1251(2):191-197.

[14]Hernandez K,Garcia-Galan C and Fernandez-Lafuente R.Simple and efficient immobilization of lipase B from Candida antarctica on porous styrene-divinylbenzene beads[J].Enzyme Microb Tech,2011,49(1):72-78.

[15]Kramer M,Cruz JC,Pfromm PH,Rezac ME and Czermak P.Enantioselective transesterification by Candida antarctica Lipase B immobilized on fumed silica[J].J Biotechnol,2010,150(1):80-86.

[16]Severac E,Galy O,Turon F,Pantel CA,Condoret JS,Monsan P and Marty A.Selection of CalB immobilization method to be used in continuous oil transesterification:Analysis of the economical impact[J].Enzyme Microb Tech,2011,48(1):61-70.

[17]Engstrom K,Vallin M,Hult K and Backvall JE.Kinetic resolution of diarylmethanols using a mutated variant of lipase CALB[J].Tetrahedron,2012,68(37):7613-7618.

[18]Engstrom K,Vallin M,Syren PO,et al.Mutated variant of Candida antarctica lipase B in(S)-selective dynamic kinetic resolution of secondary alcohols[J].ORGANIC&BIOMOLECULAR CHEMISTRY,2011,9(1):81-82.

[19]Takanori T,Takumi O,Tohru A,et,al.Development of yeast cells displaying Candida antarctica lipase B and their applica tion to ester synthesis reaction[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,75(6):1319-1325.