PAX－5、CD117、PDGFRA在胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)及意義

葉郁紅 張 聲＊ 葉建剛 王行富 陳余朋 王鵬程

（1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福州350005；2福建省福州肺科醫(yī)院 福州350008）

PAX－5（paired－box domain 5）又稱B細(xì)胞特異性激活蛋白（B cell specific activator protein，BSAP），是1989年由Barberis等［1］確認(rèn)的一種B細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)B細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化起著關(guān)鍵作用。CD117和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體 α（platelet－derived growth factor receptor alpha，PDGFRA））屬于酪氨酸激酶受體，是胃腸道間質(zhì)瘤相對(duì)特異性的標(biāo)記和分子治療的靶點(diǎn)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，PAX－5、CD117、PDGFRA 在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中表達(dá)，但多是局限于肺內(nèi)的研究，關(guān)于這三者在胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastrointestinal neuroendocrine neoplasm，GINEN）中的表達(dá)研究很少，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)分析PAX－5、CD117、PDGFRA、P53、Ki－67在 GINEN 中的表達(dá)情況，旨在發(fā)現(xiàn)與GINEN的腫瘤分級(jí)、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后轉(zhuǎn)歸相關(guān)的指標(biāo)，為進(jìn)一步開展GINEN的分子靶向治療提供病理學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1.研究對(duì)象

復(fù)習(xí)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科1995年至2012年間材料可靠的GINEN切片，按照2010年WHO新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，得到GINEN96例，其中胃65例，小腸9例，結(jié)腸7例，闌尾4例，直腸11例；男性78例，女性18例；年齡14－80歲，平均年齡62歲。神經(jīng)內(nèi)分泌瘤1級(jí)（neuroendocrine tumor，NET1級(jí)）26例，神經(jīng)內(nèi)分泌瘤2級(jí)（neuroendocrine tumor，NET2級(jí)）4例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）66例（小細(xì)胞癌31例，大細(xì)胞癌13例，混合型神經(jīng)內(nèi)分泌癌22例）［2］。2010年WHO胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤TNM臨床分期，I期15例，II期15例，III期56例，IV期10例。術(shù)前未經(jīng)放化療且隨訪資料完整的有73例，其中死亡33例，生存時(shí)間平均17.4月；存活40例，存活者自診斷日期到隨訪日期最短2個(gè)月，最長(zhǎng)111個(gè)月，平均35.9個(gè)月。

2.方法

制備好組織芯片，采用Dako Envision二步法免疫組化染色；一抗 PAX－5、P53、Ki－67購(gòu)自 Thermo公司，CD117、PDGFRA購(gòu)自Dako公司。染色按產(chǎn)品說(shuō)明書程序進(jìn)行操作，每批實(shí)驗(yàn)均同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和空白對(duì)照。

3.結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

CD117表現(xiàn)為細(xì)胞膜染色，可伴有胞漿著色；PDGFRA為細(xì)胞漿染色。根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分率判斷結(jié)果；染色強(qiáng)度：無(wú)著色0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞所占比例：無(wú)著色0分，＜30%為1分，30%－70%為2分，＞70%為3分；兩項(xiàng)相乘，1－3分為陰性，4－9分為陽(yáng)性。PAX－5：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥30%定為陽(yáng)性。P53：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥20%定為陽(yáng)性。Ki－67：細(xì)胞核表達(dá)黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞20%定為陽(yáng)性，21%－50%定為低表達(dá)，＞50%定為高表達(dá)。

4.統(tǒng)計(jì)方法

由于NET1級(jí)和NET2級(jí)的病例數(shù)較少，本研究將這兩組合并為NET與NEC進(jìn)行比較。NET與NEC的免疫組化陽(yáng)性率的比較，不同腫瘤大小陽(yáng)性率的比較，各期陽(yáng)性率的比較，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率的比較均采用非參數(shù)檢驗(yàn)；神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤隨訪資料進(jìn)行單因素生存分析（Logrank檢驗(yàn)）和多因素生存分析（Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型）。

以上分析均采用SPSS19.0軟件包計(jì)算，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 在 GINEN的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

96例GINEN中，30例PAX－5陽(yáng)性表達(dá)，占31.3%（圖1）；19例CD117陽(yáng)性表達(dá)，占19.8%（圖2）；51例PDGFRA 陽(yáng)性表達(dá)，占53.1%（圖3）；41例P53陽(yáng)性表達(dá)，占42.7%。PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表達(dá)均與多種臨床病理因素有相關(guān)性（表1）。

2.生存分析

GINEN患者平均生存期55.9月，中位生存期40.0月，1、2、3年生存率分別為74.6%、59.6%、52.0%。經(jīng)Log－rank檢驗(yàn)，組織學(xué)類型、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CD117、P53、Ki67表達(dá)與GINEN生存期顯著相關(guān)（表2）；胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌（gastrointestinal neuroendocrine carcinoma，GINEC）的預(yù)后與CD117表達(dá)、Ki67高表達(dá)及臨床分期顯著相關(guān)（χ2＝8.685，10.124，3.912；P ＝0.003，0.001，0.048）。

將生存時(shí)間（月）、生存狀態(tài)（生存或死亡）、患者性別（男＝1，女＝2）、年齡（14－59＝1，60－80＝2）、腫瘤類型、大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無(wú)轉(zhuǎn)移＝1，有轉(zhuǎn)移＝2）、化療（無(wú)＝1，有＝2）、CD117、P53、Ki－67免疫組化結(jié)果納入Cox回歸模型。結(jié)果顯示：TNM分期、CD117表達(dá)與GINEN患者生存時(shí)間有關(guān)（表3）。其次，對(duì)GINEC進(jìn)行Cox分析，腫瘤類型（小細(xì)胞癌及非小細(xì)胞癌），Ki67（高及低表達(dá)）及相關(guān)指標(biāo)納入Cox回歸模型。結(jié)果顯示：Ki67高表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)（表4）。

表1 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53表達(dá)與GINEN患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between the expression of PAX－5、CD117、PDGFRA、P53 and the clinicopathological data in GINEN

圖1 PAX－5在胃小細(xì)胞癌中的表達(dá)（Envision×400）圖2 CD117在胃小細(xì)胞癌中的表達(dá)（Envision×400）圖3 PDGFRA在胃混合型NEC中的表達(dá)（Envision×400）Fig.1 Immunohistochemical expression of PAX－5 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.2 Immunohistochemical expression of CD117 in gastric small cell neuroendocrine carcinoma（Envision×400）Fig.3 Immunohistochemical expression of PDGFRA in gastric mixed neuroendocrine carcinoma（Envision×400）

表2 73例GINEN患者單因素分析結(jié)果Table 2 Results of the univariate analysis for 73 GINEN patients

表3 GINEN Cox模型多因素分析結(jié)果Table 3 Cox variables in the equation of GINEN

表4 GINEC Cox模型多因素分析結(jié)果Table 4 Cox variables in the equation of GINEC

討 論

GINEN是一組異質(zhì)性腫瘤，主要包括NET（1級(jí)和2級(jí)）與NEC（3級(jí)），這兩者在發(fā)病機(jī)制、臨床病理特征、治療及預(yù)后方面都有顯著不同［3］。本研究的結(jié)果顯示，NET 與 NEC在 PAX－5、CD117、PDGFRA、P53的表達(dá)上有差異。PAX－5屬于個(gè)體發(fā)育調(diào)控基因，它的異常表達(dá)促使細(xì)胞增殖、分化、凋亡出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常情況下PAX－5局限表達(dá)在淋巴及造血器官，也可作為癌基因表達(dá)于B細(xì)胞淋巴瘤和一些實(shí)體腫瘤，如Merkel細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌［4］。Kanteti等［5］通過(guò)對(duì)細(xì)胞系和腫瘤組織的表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)PAX－5在小細(xì)胞肺癌及大細(xì)胞肺癌中均有較高表達(dá)率（分別為66%和55%），類癌表達(dá)率僅為27%，而在非小細(xì)胞肺癌、間皮瘤、食管癌等其他腫瘤中均無(wú)明顯表達(dá)。Song等［6］觀察了89例肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的石蠟標(biāo)本，進(jìn)一步證實(shí)PAX－5在類癌的表達(dá)（陽(yáng)性率為29%）顯著低于非典型類癌（陽(yáng)性率為67%）、小細(xì)胞癌（陽(yáng)性率為82%）及大細(xì)胞癌（陽(yáng)性率為73%）?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)多是PAX－5在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的研究，而在GINEN的研究則未見(jiàn)報(bào)道。本研究中43.9%胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌癌表達(dá)PAX－5，略低于肺內(nèi)的表達(dá)水平；但是PAX－5顯著表達(dá)于高級(jí)別神經(jīng)內(nèi)分泌癌的規(guī)律與肺的研究結(jié)果相符合。CD117和PDGFRA是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)中的重要分子，是惡性腫瘤潛在的作用靶點(diǎn)。同PAX－5的研究相似，這兩者也都在Merkel細(xì)胞癌及肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中表達(dá)［7，8］。最近的一項(xiàng)對(duì)119例胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的表達(dá)研究顯示，CD117和PDGFRA的表達(dá)率分別為13%和33%，且二者的表達(dá)率隨著腫瘤級(jí)別的增高而上升；與之相比較，本研究CD117和PDGFRA的表達(dá)率略高（分別為19.8%和53.1%），CD117和PDGFRA在NEC表達(dá)率高，但只有PDGFRA的表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P53突變是胃癌最常見(jiàn)的遺傳學(xué)改變，Erler等指出［8］70%胃NEC有P53過(guò)表達(dá)，但胃NET只有14%。本研究中59.1%胃腸NEC表達(dá)P53，6.7%胃腸NET表達(dá)P53，與文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)大致相符。因此，PAX－5、PDGFRA、P53的顯著表達(dá)差異進(jìn)一步證實(shí)NET與NEC之間有著不同的發(fā)病機(jī)制；對(duì)于形態(tài)上介于高、低級(jí)別之間的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，這3者的表達(dá)可能成為分級(jí)的輔助手段。其次，本研究PAX5、CD117、PDGFRA及P53的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有顯著相關(guān)性，提示可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，有待進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

內(nèi)分泌腫瘤病人常處于晚期，缺少有效的治療方式，分子靶向治療成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)［10］。研究表明PAX－5能夠上調(diào)c－Met轉(zhuǎn)錄因子在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及侵襲；而敲除或降低PAX－5基因表達(dá)與應(yīng)用c－Met抑制劑有協(xié)同殺死小細(xì)胞肺癌的作用［5，6］。本研究的數(shù)據(jù)顯示，PAX－5在部分GINEN表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，提示PAX－5可以作為GINEN治療的潛在靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)的研究來(lái)加以證實(shí)。另外，雖然CD117和PDGFRA在GINEN有表達(dá)，但文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)突變；Gilbert等復(fù)習(xí)了104例神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，指出其缺乏CD117和PDGFR的分子突變［12］；Knosel等［9］也只發(fā)現(xiàn)1例胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤有c－Kit突變。有的文獻(xiàn)甚至認(rèn)為格列衛(wèi)對(duì)惡性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤似乎并無(wú)多大治療效果，反而有明顯的毒性［11］。因此格列衛(wèi)能否應(yīng)用于GINEN的治療有待于收集更多的臨床數(shù)據(jù)來(lái)加以分析。

GINEN是一組惡性腫瘤，預(yù)后因素包括性別、年齡、種族、診斷時(shí)年齡、腫瘤分期以及組織學(xué)分級(jí)等［13］。本研究的結(jié)果顯示，CD117、P53、Ki－67的表達(dá)與GINEN預(yù)后差相關(guān)，這與Erler等［8］對(duì)肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的研究結(jié)果一致。最近的對(duì)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的研究［9］認(rèn)為CD117及PDGFRA的表達(dá)與預(yù)后差顯著相關(guān)，且PDGFRA可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子，而本研究中CD117及臨床分期作為GINEN的獨(dú)立預(yù)后因子。對(duì)于本組病例的主要成員GINEC，Ki67高指數(shù)可以作為其獨(dú)立的預(yù)后因子，Boo等的研究也發(fā)現(xiàn)高增殖指數(shù)（Ki－67＞60%）可作為胃侵襲性NEC的預(yù)后指標(biāo)［14］。

綜上所述，PAX－5、CD117、PDGFRA、P53可能參與了GINEN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但其確切的機(jī)制尚不清楚；其次CD117表達(dá)是GINEN的獨(dú)立預(yù)后因子，Ki67高指數(shù)是GINEC的獨(dú)立預(yù)后因子；最后，PAX－5可以作為GINEN治療的潛在靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

［1］Barberis A，SuPerti－Furga G，Vitelli L，et al.Developmental and tissue－specific regulation of a novel transcription factor of the sea urchin.Genes ＆Dev，1989，3（5）：663－675

［2］葉郁紅，張聲，王行富等.90例胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理學(xué)重新診斷評(píng)估.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，41（4）：440－444

［3］Yachida S，Vakiani E，White CM，et al.Small cell and large cell neuroendocrine carcinomas of the pancreas are genetically similar and distinct from well－differentiated pancreatic neuroendocrine tumors.Am J Surg Pathol，2012，36（2）：173－184

［4］Mhaweeh－Fauceglia P，Saxena R，Zhang S，et al.Pax－5 immunoexpression in various types of benign and malignant tumours：a high－throughput tissue microarray analysis.J Clin Pathol，2007，60（6）：709－714

［5］Kanteti R，Nallasura V，Loganathan S，et al.Pax5 is expressed in small cell lung cancer and positively regulates c－met transcription.Lab Invest，2009，89（3）：301－314

［6］Song J，Li M，Tretiakova M，et al.Expression patterns of PAX5，c－Met，and paxillin in neuroendocrine tumors of the lung.Areh Pathol Lab Med，2010，134（11）：1702－1705

［7］Kartha RV，Sundram UN.Silent mutations in KIT and PDGFRA and coexpression of receptors with SCF and PDGFA in Merkel cell carcinoma：implications for tyrosine kinase－based tumorigenesis.Mod Pathol，2008，21（2）：96－104

［8］Erler BS，Presby MM，F(xiàn)inch M，et al.CD117，Ki－67，and p53 predict survival in neuroendocrine carcinomas，but not within the subgroup of small cell lung carcinoma.Tumor Biol，2011，32（1）：107－111

［9］Knosel T，Chen Y，Altendorf－Hofmann A，et al.High KIT and PDGFRA are associated with shorter patients survival in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors，but mutations are a rare event.J Cancer Res Clin Oncol，2012，138（3）：397－403

［10］陳旭升，孫丹，姚欣.PDGF和PDGFR與腫瘤的關(guān)系及其靶向治療研究進(jìn)展.中國(guó)腫瘤臨床，2012，39（15），1134－1137

［11］J Gross D，Munter G，Bitan M，et al.The role of imatinib mesylate（Glivec）for treatment of patients with malignant endocrine tumors positive for c－kit or PDGFR.Endocr Relat.Cancer，2006，13：535－540

［12］A Gilbert J，J Adhikari L，V Lloyd R，et al.Molecular markers for novel therapies in neuroendocrine （carcinoid）tumors.Endocr Relat Cancer，2010，17：623－636

［13］Yao JC，Hassan M，Phan A，et al.One hundred years after“carcinoid”：epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35，825 cases in the United States.J Clin Oncol，2008，26（18）：3063－3072

［14］Boo YJ，Park SS，Kim JH，et al.Gastric neuroendocrine carcinoma：clinicopathologic review and immunohistochemical study of E－cadherin and Ki－67 as prognostic markers.J Surg Oncol，2007，95（2）：110－117