ROC曲線(xiàn)對(duì)ELISA檢測(cè)丙型肝炎抗體陽(yáng)性判斷值的確定和分析

唐 婧，包建玲，孟存仁，張朝霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊830054)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的丙型病毒性肝炎呈全球分布，大約有1.7億人為HCV感染者，占世界人口的3%，且發(fā)展中國(guó)家高于發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。丙型肝炎病毒抗體(抗HCV)是目前應(yīng)用最廣泛的用于流行病學(xué)調(diào)查、臨床丙型肝炎患者篩查和診斷的檢測(cè)項(xiàng)目，為丙型肝炎的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了可靠的依據(jù)[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是抗HCV檢測(cè)最常用的方法。在免疫定性測(cè)定中，確定合適的陽(yáng)性判斷值(Cut-off值)對(duì)減少假陽(yáng)性和假陰性，確保試驗(yàn)的敏感性和特異性具有重要意義[3]。研究表明受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線(xiàn)是設(shè)定 Cut-off值的最佳方法[4]。我們采用ROC曲線(xiàn)確定實(shí)驗(yàn)室兩種不同酶免分析系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值，以提高ELISA檢測(cè)抗HCV的敏感性和特異性。

材料和方法

一、研究對(duì)象

使用盲法收集2013年3月至2013年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心血清標(biāo)本202份，分離血清，置－80℃保存待測(cè)。標(biāo)本來(lái)源對(duì)象年齡1～82歲，男93例，女109例，其中132份來(lái)自肝病科門(mén)診和住院患者、70份來(lái)自普通門(mén)診患者和體檢者。

二、儀器與試劑

addcare ELISA 1100全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱(chēng)ddcare ELISA 1100，煙臺(tái)生物科技有限公司);TECAN加樣系統(tǒng)(瑞士帝肯公司);FAME后處理系統(tǒng)(瑞士哈美頓公司)?？笻CV確證試劑盒[重組免疫印跡法(recombinant immunoblot assay，RIBA)]由北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供(批號(hào)為RC20130101);抗HCV診斷試劑盒由(ELISA)北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供(批號(hào)為C20130406)。所有試劑均在有效期內(nèi)使用，按說(shuō)明書(shū)操作。

三、方法

1.標(biāo)本檢測(cè) 對(duì)－80℃保存待測(cè)的202份血清標(biāo)本分別用上述指定廠家的抗HCV診斷試劑(ELISA)和抗HCV確證試劑(RIBA)進(jìn)行抗HCV測(cè)定和抗HCV確認(rèn)，記錄吸光度(A)值，其中ELISA分別用addcare ELISA 1100和TECAN+FAME組合酶免分析系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱(chēng)TECAN+FAME酶免系統(tǒng))進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前兩種系統(tǒng)均進(jìn)行了校準(zhǔn)和性能驗(yàn)證。

2.RIBA確認(rèn)結(jié)果判定 條帶強(qiáng)度的判讀和結(jié)果的解釋見(jiàn)表1和表2。

表1 RIBA抗HCV反應(yīng)條帶強(qiáng)度的判讀標(biāo)準(zhǔn)

表2 RIBA抗HCV反應(yīng)結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)

3.質(zhì)量控制 ELISA檢測(cè)每一批分別設(shè)定2個(gè)陰性對(duì)照、2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和1個(gè)質(zhì)控，其中陰性對(duì)照孔A值≤0.08，陽(yáng)性對(duì)照孔A值≥0.50，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，質(zhì)控孔S/CO值在2.39～4.96的范圍內(nèi)。RIBA檢測(cè)每一批分別設(shè)定1個(gè)陰性對(duì)照和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，其中陰性對(duì)照出現(xiàn)對(duì)照線(xiàn)-1和對(duì)照線(xiàn)-2，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn) Core、NS3、NS4-1、NS4-2、NS5、對(duì)照線(xiàn)-1和對(duì)照線(xiàn)-2，且每條試驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照線(xiàn)-1和對(duì)照線(xiàn)-2均必須出現(xiàn)，如果對(duì)照線(xiàn)-1和對(duì)照線(xiàn)-2均不出現(xiàn)或僅出現(xiàn)1條，則此條的檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。試驗(yàn)均有良好的質(zhì)量控制。

4.Cut-off值的驗(yàn)證 EP12-A文件Cut-off值的驗(yàn)證方法:(1)準(zhǔn)備具有臨界值濃度和濃度在臨界值±20%的標(biāo)本，標(biāo)本的量要充足，以保證同一份樣本能重復(fù)測(cè)定20次;(2)重復(fù)測(cè)定每個(gè)標(biāo)本20次，計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本的陰性和陽(yáng)性百分比;(3)估計(jì)的臨界值是否準(zhǔn)確，如果準(zhǔn)確，同一份樣本重復(fù)測(cè)定的結(jié)果應(yīng)該有50%陽(yáng)性和50%陰性結(jié)果;(4)臨界值±20%的濃度范圍是否位于該實(shí)驗(yàn)方法的“95%區(qū)間”，當(dāng)臨界值+20%濃度的標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率≥95%，且臨界值－20%濃度的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陰性率≥95%，則該濃度范圍≥該方法95%區(qū)間;此時(shí)，標(biāo)本濃度在臨界值±20%濃度范圍之外就能得到穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用抗HCV A值做ROC曲線(xiàn)，計(jì)算曲線(xiàn)下面積，并探討其最佳臨界值即約登指數(shù)最大時(shí)的Cut-off值，且約登指數(shù)為敏感性與特異性之和減去1，從而確定抗HCV診斷價(jià)值最大時(shí)的Cut-off值。用配對(duì)四格表卡方檢驗(yàn)探討ROC曲線(xiàn)確定的兩種不同酶免分析系統(tǒng)ELISA檢測(cè)抗HCV最佳Cut-off值下的檢測(cè)結(jié)果的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RIBA確認(rèn)檢測(cè)結(jié)果

RIBA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性142份，陰性60份。其中142份RIBA陽(yáng)性標(biāo)本5個(gè)抗原區(qū)條帶強(qiáng)度分布情況見(jiàn)表3。142份RIBA陽(yáng)性標(biāo)本中，Core蛋白、NS3蛋白、NS4-1蛋白、NS4-2蛋白和NS5蛋白陽(yáng)性的分別有142份、141份、80份、16份和68份，其中強(qiáng)度為2+的分別有125份(88%)、121份(85%)、61份(43%)、9份(6%)和 56份(39%)，強(qiáng)度為1+的分別有17份(12%)、20份(14%)、19份(13%)、7份(5%)和12份(8%)。

表3 142份RIBA陽(yáng)性標(biāo)本5個(gè)抗原區(qū)條帶強(qiáng)度分布情況

二、ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果

以RIBA檢測(cè)結(jié)果為參照，繪制兩種酶免分析系統(tǒng)不同陽(yáng)性判斷值的ROC曲線(xiàn)。addcare ELISA 1100檢測(cè)抗 HCV的最佳 Cut-off值為0.448，敏感性為 99.3%，特異性為 96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線(xiàn)下面積為 0.998，見(jiàn)圖 1。TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值為 0.406，敏感性為 99.3%，特異性為96.7%，約登指數(shù)為 0.960，ROC 曲線(xiàn)下面積為0.998，見(jiàn)圖2。兩種系統(tǒng)不同臨界值時(shí)的敏感性和特異性見(jiàn)表4和表5。對(duì)比兩種系統(tǒng)采用ROC曲線(xiàn)確定的最佳Cut-off值下的抗HCV檢測(cè)結(jié)果，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。見(jiàn)表6。

圖1 addcare ELISA 1100檢測(cè)抗HCV的ROC曲線(xiàn)圖

圖2 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的ROC曲線(xiàn)圖

表4 addcare ELISA 1100不同臨界值下的敏感性和特異性

表5 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)不同臨界值下的敏感性和特異性

表6 兩種系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值下的檢測(cè)結(jié)果 (例)

三、Cut-off值的驗(yàn)證結(jié)果

addcare ELISA 1100檢測(cè)抗HCV的最佳Cutoff值為0.448。一個(gè) A值約為0.448的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得50%陽(yáng)性結(jié)果和50%陰性結(jié)果。一個(gè)A值約為0.538(臨界值+20%)的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得的陽(yáng)性率為95%。一個(gè)A值約為0.358(臨界值－20%)的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得的陰性率為100%。

TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值為0.406。一個(gè)A值約為0.406的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得50%陽(yáng)性結(jié)果和50%陰性結(jié)果。一個(gè)A值約為0.487(臨界值+20%)的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得的陽(yáng)性率為95%。一個(gè)A值約為0.325(臨界值－20%)的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定20次獲得的陰性率為100%。

討 論

ELISA是目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)方法，其判斷測(cè)定結(jié)果的依據(jù)主要依靠所謂的“陽(yáng)性判斷值”，即Cut-off值。雖然各廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒均提供Cut-off值的計(jì)算方法，但不同批試劑盒使用相同Cut-off值。多年使用同一Cut-off值的現(xiàn)象普遍存在，這顯然存在不合理性。由于試劑盒生產(chǎn)工藝的不均一性，各批試劑盒的反應(yīng)效果不盡相同，所得的Cut-off值應(yīng)當(dāng)不同。此外，環(huán)境溫度、加樣體積誤差、洗板效果等方面均是影響ELISA檢測(cè)性能的因素。為此，各實(shí)驗(yàn)室需自行設(shè)定并計(jì)算適合本實(shí)驗(yàn)室的Cutoff值[5]。

本研究中的兩種系統(tǒng)(addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系統(tǒng))雖然使用同一種抗HCV診斷試劑盒，但是addcare ELISA 1100是加樣、后處理一體機(jī)，有2個(gè)工作艙(前、后艙自動(dòng)轉(zhuǎn)板，避免污染)和3臺(tái)獨(dú)立洗板機(jī)(前后艙均可使用，每臺(tái)洗板機(jī)均為96針洗板頭，洗板強(qiáng)度大、效果好)，開(kāi)放操作(易受環(huán)境溫度干擾);TECAN+FAME酶免系統(tǒng)是TECAN加樣系統(tǒng)和FAME后處理系統(tǒng)組合的酶免分析系統(tǒng)，人為轉(zhuǎn)板，易污染，2臺(tái)洗板機(jī)(每臺(tái)洗板機(jī)均為24針洗板頭，洗板效果較差)，后處理機(jī)內(nèi)部操作(受環(huán)境溫度干擾小)。針對(duì)以上不同點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室有必要分別確定兩種系統(tǒng)ELISA各自的檢測(cè)抗HCV的Cutoff值。

Cut-off值的設(shè)定方法一般有標(biāo)準(zhǔn)差比率、測(cè)定標(biāo)本對(duì)陰性比值、以陰性對(duì)照均值±2s或3s、百分位數(shù)法、雙質(zhì)控、ROC曲線(xiàn)等[4]。不同的方法設(shè)定的Cut-off值有一定的差異，但都要綜合考慮假陽(yáng)性率和假陰性率。在各種Cut-off值的計(jì)算方法中，ROC曲線(xiàn)法已得到了實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可[6]。該方法考慮了每一個(gè)可能的Cut-off值，因而能夠更客觀地評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的診斷價(jià)值和確定最佳臨界值。

本研究通過(guò)ROC曲線(xiàn)確定addcare ELISA 1100檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值為0.448，敏感性為 99.3%，特異性為 96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線(xiàn)下面積為0.998;TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的最佳Cut-off值為0.406，敏感性為99.3%，特異性為96.7%，約登指數(shù)為0.960，ROC 曲線(xiàn)下面積為0.998。

伍建寧等[7]研究通過(guò)對(duì)5 709份無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本的抗HCV ELISA檢測(cè)的A值的統(tǒng)計(jì)和RIBA檢測(cè)，確認(rèn)Cut-off值以0.112為宜，與本研究所確定的Cut-off值(0.448和0.406)相差較大。其原因可能有:(1)Cut-off值的設(shè)定方法不同，伍建寧等[7]的Cut-off值的設(shè)定方法為百分位數(shù)法單側(cè)99%，本研究Cut-off值的設(shè)定方法為ROC曲線(xiàn)法;(2)儀器與試劑不同，伍建寧等[7]使用Genesis RSP-200型全自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)加樣，德國(guó)BEPⅢ全自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行后處理及檢測(cè)，本研究分別使用 addcare ELISA 1100和 TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)，伍建寧等[7]研究抗 HCV ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自廈門(mén)新創(chuàng)生物工程公司，抗HCV RIBA 3.0SIA確認(rèn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Chiron公司，本研究抗HCV ELISA測(cè)定試劑盒和抗HCV RIBA確認(rèn)試劑盒均購(gòu)自同一家公司;(3)標(biāo)本來(lái)源不同，伍建寧等[7]研究標(biāo)本來(lái)自5 709份無(wú)償獻(xiàn)血者，本研究標(biāo)本來(lái)自202份臨床檢測(cè)者。采供血系統(tǒng)血液篩檢抗HCV，Cut-off值的設(shè)定應(yīng)略低于臨床抗HCV檢測(cè)，這對(duì)于減少HCV的經(jīng)輸血傳播具有重要意義[7]。

抗HCV診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)上提供的Cut-off值的計(jì)算公式為臨界值=陰性對(duì)照孔A均值+0.12(不足0.02按0.02計(jì)算)。因此通常情況下所計(jì)算出的Cut-off值為0.140，與本研究所確定的Cut-off值(0.448和0.406)相差較大。若按照說(shuō)明書(shū)上提供的Cut-off值判斷陰性和陽(yáng)性標(biāo)本，雖然敏感性較高，但是特異性較低，即易出現(xiàn)假陽(yáng)性。再者，由于ELISA方法學(xué)上的缺陷，抗HCV檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因有:(1)高球蛋白血癥[4];(2)類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)的干擾，如血清或血漿標(biāo)本中存在RF，則其可與固相上的IgG和酶標(biāo)記的IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng);(3)標(biāo)本中超氧化物歧化酶的干擾;(4)用于固相包被的HCV基因工程抗原不純[8];(5)試劑保存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的影響[9]。因此會(huì)增加臨床抗HCV檢測(cè)的誤診率。若按照本研究確定的Cut-off值判斷陰性和陽(yáng)性標(biāo)本，雖然敏感性降低，但是特異性升高，即易出現(xiàn)假陰性?？笻CV檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的原因有:(1)HCV感染后到抗體的出現(xiàn)有一個(gè)較長(zhǎng)的窗口期(平均為6～12周)[10];(2)HCV 感染的其它階段。因此會(huì)提高臨床抗 HCV檢測(cè)的漏診率。ELISA技術(shù)本身在Cut-off值的設(shè)置上存在局限性，也就是說(shuō)在Cut-off值周?chē)欢▍^(qū)域內(nèi)，測(cè)定結(jié)果難以明確判斷是陰性還是陽(yáng)性，即所謂的灰區(qū)，而這個(gè)灰區(qū)到底有多大，在國(guó)內(nèi)使用的ELISA試劑盒中均無(wú)說(shuō)明。這種一刀切的判斷方式所得到的結(jié)果存在假陰性的可能[7]。

綜上所述，雖然從理論上而言，ROC曲線(xiàn)是設(shè)定Cut-off值的最佳方法，但是由于ELISA測(cè)定通常有較大的變異，其每次測(cè)定的Cut-off值都會(huì)有所差異，因此需要控制Cut-off值的批間變異，但在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性[3]。因此，綜合抗HCV診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)上提供的Cut-off值(0.140)和經(jīng)ROC曲線(xiàn)確定的兩種系統(tǒng)的Cut-off值(0.448和 0.406)的診斷性能，將本實(shí)驗(yàn)室addcare ELISA 1100和TECAN+FAME酶免系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV的“灰區(qū)”分別設(shè)定為0.140～0.448和0.140～0.406。對(duì)于ELISA檢測(cè)抗HCV中的“灰區(qū)”結(jié)果，最好采用較為敏感和特異的方法進(jìn)行復(fù)檢，以免誤診和漏診。有條件的實(shí)驗(yàn)室可以用確認(rèn)試驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。

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