老芒麥種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析

顧曉燕，郭志慧，張新全，周永紅，白史且，張昌兵，蔣忠榮，劉新，周朝杰，馬嘯*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 雅安625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都，611130;3.四川省草原科學(xué)研究院，四川成都611731;4.四川省甘孜藏族自治州畜牧科學(xué)研究所，四川康定626000)

研究和了解植物種質(zhì)間的遺傳變異，對于其在育種上的有效利用非常有益。根據(jù)遺傳變異的信息，可以確定具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的親本組合［1］，拓寬植物品種的遺傳基礎(chǔ)，防止其育種進(jìn)程中的漸進(jìn)性遺傳衰退。另外，遺傳多樣性還可以為物種保護(hù)計劃的制定和實施提供參考和借鑒。

老芒麥(Elymus sibiricus)，別名西伯利亞野麥草，是披堿草屬的模式種，為多年生、疏叢型、自花授粉的異源四倍體禾草，具有StStHH的染色體組構(gòu)成［2］。它是歐亞大陸的廣布種，在北美的阿拉斯加和加拿大北部也有少量分布［3］。老芒麥一般生長于濕潤的草地、河灘、灌木叢中或森林邊緣地帶。在中亞及中國新疆、內(nèi)蒙古和青藏高原地區(qū)，老芒麥作為一種重要的牧草在草地畜牧業(yè)中發(fā)揮了巨大作用［4-6］。

目前對老芒麥種質(zhì)的遺傳多樣性研究很少。袁慶華等［7］發(fā)現(xiàn)21份老芒麥種質(zhì)在13個農(nóng)藝和形態(tài)學(xué)性狀上存在高度變異。但形態(tài)性狀具有不少缺點，如數(shù)目有限、易受環(huán)境影響和非均勻分布等。DNA分子標(biāo)記的發(fā)展，極大地增加了研究遺傳多樣性的方法，它可以揭示整個基因組上可能存在的大量變異［8］。序列相關(guān)擴增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphisms，SRAPs)是一種簡單的分子標(biāo)記系統(tǒng)，已經(jīng)在植物分子作圖和基因定位上被證明其有效性［9］。該技術(shù)是基于正向和反向引物對模板DNA的PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴增，引物具有3個明顯不同的序列框:5'端存在的10～11個隨機堿基序列，緊跟著CCGG(正向引物)或AATT(反向引物)的堿基序列，最后是位于3'端的3個選擇性堿基。從技術(shù)的可操作性來看，每個引物5'端的10個隨機堿基序列可以促進(jìn)任意序列的擴增，即類似于RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記)標(biāo)記的結(jié)果［10］。正向引物的CCGG序列可以優(yōu)先與具有豐富GC堿基的外顯子序列退火結(jié)合，而反向引物的AATT序列可優(yōu)先與具有豐富AT堿基的內(nèi)含子和啟動子序列退火結(jié)合［9］。引物3'端的3個選擇性堿基可以對模板DNA進(jìn)行選擇，與在AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)選擇性擴增中使用的引物的3'端很相似［11］。基于這種獨特的引物設(shè)計，SRAP標(biāo)記具有相對于其他標(biāo)記更好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和簡易性。SRAP 標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于蕓苔屬(Brassica)［9］、南瓜屬(Cucurbita)［12］、野牛草(Buchloe dactyloides)［13］、紫花苜蓿(Medicago sativa)［14］、黑麥草(Lolium)［15］和芍藥屬(Paeonia)［16］。Budak 等［17］發(fā)現(xiàn)在揭示遺傳關(guān)系相近的野牛草品種間的遺傳多樣性時SRAP標(biāo)記比SSR(simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性)和RAPD標(biāo)記更加有效。

比較具有不同地理分布的植物種質(zhì)，是進(jìn)化生物學(xué)和植物育種學(xué)的重要研究內(nèi)容。因此，老芒麥地理分布的遺傳變異研究，對于收集和管理其種質(zhì)資源非常重要。然而，目前還未見對不同國家或大的生態(tài)區(qū)來源的老芒麥種質(zhì)的遺傳多樣性水平研究的報道。本研究的目的在于:1)評價SRAP標(biāo)記在老芒麥種質(zhì)研究中的有效性;2)確定來自于3個國家的84份老芒麥種質(zhì)間的遺傳關(guān)系;3)檢測遺傳多樣性水平與地理來源的關(guān)系。這是首次關(guān)于利用SRAP標(biāo)記檢測老芒麥遺傳多樣性的研究報告。

1 材料與方法

1.1 植物材料

84份老芒麥供試種質(zhì)分別從美國國家遺傳資源庫(NPGS，USDA)、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所和四川草原科學(xué)研究院獲得(表1)。種質(zhì)的護(hù)照信息顯示它們分別采集自俄羅斯(西伯利亞地區(qū)為主)、蒙古國、中國新疆、中國的青藏高原地區(qū)(川西北高原為主)。每份材料取10～20粒種子，置于有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)的吸水濾紙上萌發(fā)。萌發(fā)后的種子轉(zhuǎn)移至內(nèi)含砂子－泥炭混合基質(zhì)的盆缽內(nèi)生長，盆缽置于溫室內(nèi)。植株生長至開花期進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，標(biāo)本憑證保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系。

1.2 DNA 提取

每份種質(zhì)采集5～10個單株的等量新鮮葉片，用液氮研磨成粉，保存于－80℃低溫冰箱內(nèi)?；蚪MDNA提取參照Doyle［18］描述的CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法進(jìn)行。對比已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)λDNA與樣本DNA在0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠上的電泳圖譜，利用Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)，計算出老芒麥各種質(zhì)的DNA濃度。將所有樣本的基因組DNA用0.1×TE緩沖液［1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，pH 8.0］稀釋至 10 ng/μL，儲存于 －80℃冰箱內(nèi)，供SRAP擴增使用。

1.3 SRAP 擴增

引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成(表2)。PCR反應(yīng)混合液(20 μL總體積)由0.2 mmol/L dNTPs，0.3 μmol/L 正向和反向引物，2.5 mmol/L Mg2+，10 × Taq buffer，1 U Taq DNA 聚合酶(北京天根生物技術(shù)公司)，40 ng模板DNA組成。擴增在PTC-200熱循環(huán)儀內(nèi)進(jìn)行(MJ Research，Waltham MA，USA)，采用以下PCR程序:94℃初變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，共5個循環(huán);在隨后的30個循環(huán)中，退火溫度增加至50℃;最后72℃延伸8 min。PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含有0.1 mg/mL的溴化乙錠)上用0.5×TBE(tris-borate-edta，三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸)緩沖液進(jìn)行電泳分離，并用BIO－RAD自動凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

只記錄清晰可辨的SRAP擴增條帶，排除弱帶和彌散帶。對所有材料，有帶(即具有相同分子量)記作1，無帶記作0，形成原始二元數(shù)據(jù)矩陣。

用NTSYS-pc2.11x軟件分析二元矩陣，計算各種質(zhì)間的Nei和Li［19］遺傳相似系數(shù)，利用SAHN模塊，基于UPGMA法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類樹形圖。利用NTSYS-pc2.11x軟件基于聚類樹矩陣計算其協(xié)表征矩陣(cophenetic matrix)，再利用Mantel檢驗，計算遺傳相似性(GS)矩陣與協(xié)表征矩陣間的相關(guān)系數(shù)，從而反映聚類結(jié)果與GS矩陣的符合度［20］。利用WINBOOT軟件［21］基于bootstrap重抽樣法，對聚類樹形圖節(jié)點分支的可靠性進(jìn)行了檢測［22］，設(shè)定重復(fù)抽樣次數(shù)為1000。除聚類分析外，利用NTSYS-pc2.11x軟件，基于GS矩陣還進(jìn)行了主向量分析(PCoA，principal coordinates analysis)，特征向量以二維形式顯示。PCoA分析可以直觀地觀察各種質(zhì)間的相關(guān)程度，這是因為二維圖上各點之間的距離，反映了各點所代表的各種質(zhì)之間的遺傳相似性。

表1 老芒麥種質(zhì)材料地理來源Table 1 List of geographical origin of E.sibiricus germplasm material

續(xù)表1 Continued

表2 SRAP正向和反向引物序列Table 2 Sequences of forward and reverse SRAP primers

對每對引物擴增的條帶而言，下列參數(shù)即:總擴增帶數(shù)(total number of bands，TNB)、多態(tài)性帶數(shù)(number of polymorphic bands，NPB)、多態(tài)性條帶百分比 (percentage of polymorphic bands，PP)、多態(tài)性信息量(polymorphic information content，PIC)［也可稱作雜合度(heterozygosity，H)］、條帶信息指數(shù)(band informativeness，BI)、分辨力(resolving power，RP)和標(biāo)記指數(shù)(marker index，MI)按下文所述進(jìn)行計算。PP=NPBs/TNB，PICi=2fi(1 － fi)，式中，PICi是第i個標(biāo)記的PIC值，fi是擴增帶等位基因(即記為“1”的條帶)的頻率，而(1－fi)是無效帶等位基因(即記為“0”的條帶)的頻率［23］。對每個引物組合而言，計算PIC應(yīng)該求平均值［或稱之為平均雜合度(average heterozygosity，Hav)，即PICav=Hav=∑PICi/N，式中，N是各引物對產(chǎn)生的多態(tài)性帶數(shù)(NPB);BIi=1－(2×|0.5－fi|)，式中，BIi是第i個標(biāo)記的BI值，fi是各種質(zhì)具有的擴增帶(即記為“1”的條帶)的頻率，而RP=∑BIi。對每對SRAP引物而言，計算BI時應(yīng)該求平均值，即BIav=∑BIi/N，式中，N是各引物對產(chǎn)生的多態(tài)性帶數(shù)(NPB)。對每個引物組合而言，標(biāo)記指數(shù)(MI)可以按下述公式計算:MI=NPB×PICav［24］，式中，NPB是每對SRAP引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)。

為了解老芒麥種質(zhì)不同地理類群間和類群內(nèi)的SRAP變異，利用ARLEQUIN 3.1軟件進(jìn)行了分子變異方差分析(AMOVA)［25］，計算類群間的遺傳分化系數(shù)ΦST。同時利用AMOVA分析，還可以得到不同地理類群間的遺傳距離(稱之為Φ統(tǒng)計量)［26］。方差成分及類群間遺傳距離的顯著性檢測采用9999次隨機置換進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 分析

從140個引物組合中，篩選出23個可以產(chǎn)生清晰可辨條帶的引物組合。這23個引物組合對84份老芒麥種質(zhì)共產(chǎn)生337條擴增帶，分子量范圍為75～1580 bp(圖1)。其中，203條(60.24%)為多態(tài)性帶(表3)。單個引物組合產(chǎn)生的多態(tài)性帶為2～19條。平均每個引物組合產(chǎn)生14.7條帶，其中多態(tài)性帶為8.8條。單個引物的PIC值在0.151～0.438之間變化，平均值為0.284(表3)。引物組合的平均條帶信息指數(shù)值為0.408，變幅為0.230(Em9+Me15)～0.696(Em12+Me16);23個引物組合的標(biāo)記分辨力(RP)的變幅為1.119(Em12+Me5)～9.333(Em1+Me10)，平均值為3.631。具有較高的分辨力和標(biāo)記指數(shù)的引物組合一般同時具有較高的多態(tài)性，能夠辨別更多的種質(zhì)。

圖1 引物組合Me5+Em19對84份老芒麥種質(zhì)的擴增帶型Fig.1 SRAP profile of E.sibiricus collections amplified using the primer pair Me5+Em19

2.2 種質(zhì)間的遺傳相似性

84份種質(zhì)間的遺傳相似性(GS)系數(shù)變幅為0.783(204251與PI610886)～0.965(205119與205151)，平均值為0.865。圖2描述了3486個GS值的頻數(shù)分布。前2個最高的GS值頻數(shù)分別分布在0.886～0.891和0.880～0.885。約95%的 GS值分布在0.810 ～0.921之間，只有0.8%的 GS值高于0.93，同時也只有0.1%的 GS值低于0.80。這說明供試材料間的遺傳關(guān)系較近。

2.3 聚類系統(tǒng)樹和主向量分析(PCA)對種質(zhì)的劃分

基于SRAP標(biāo)記的UPGMA系統(tǒng)樹(圖3)，揭示了84份老芒麥種質(zhì)間的遺傳關(guān)系。系統(tǒng)樹可以在不同的GS水平上將供試種質(zhì)劃歸為不同的組群。在GS=0.84的水平上，供試種質(zhì)可以被劃分成2個明顯不同的組群。第Ⅰ組群包括來自于俄羅斯(20份)、蒙古(16份)和中國新疆(23份)的種質(zhì)。第Ⅱ組群包括全部來自于青藏高原的25份種質(zhì)。第Ⅱ組群又可劃分為3個亞組:亞組1包括甘肅種質(zhì)3份、青海種質(zhì)2份，西藏種質(zhì)1份;亞組2包括13份四川種質(zhì)和2份甘肅種質(zhì);亞組3包括3份四川種質(zhì)和1份西藏種質(zhì)。協(xié)表征矩陣與GS矩陣間的相關(guān)系數(shù)達(dá)0.88，說明聚類結(jié)果與原始GS矩陣能較好地吻合?；贐ootstrap分析所得的對系統(tǒng)樹分支節(jié)點置信度的支持值(bootstrap value)被標(biāo)注在圖3中聚類圖上。共有19個分支節(jié)點具有高于50%的置信度。第Ⅰ和第Ⅱ組分支節(jié)點被91%和100%的bootstrap值支持，表明了青藏高原來源的種質(zhì)類群(Ⅱ)與其他地理來源的種質(zhì)類群(Ⅰ)具有明顯差異。

表3 23對SRAP引物對84份老芒麥種質(zhì)產(chǎn)生的總擴增帶數(shù)(TNB)、多態(tài)性帶數(shù)(NPB)、多態(tài)性條帶百分比(PP)、多態(tài)性信息量(PIC)、條帶信息指數(shù)(BI)、條帶分辨力(RP)和標(biāo)記指數(shù)(MI)Table 3 Total number of bands(TNB)，number of polymorphic bands(NPB)，percent polymorphism(PP)，polymorphic information content(PIC)，band informativeness(BI)，resolving power(RP)and marker index(MI)of the 23 primer combinations used to generate SRAP markers in 84 E.sibiricus accessions

圖2 基于203條多態(tài)帶計算出的84份老芒麥種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)的分布Fig.2 The distribution of genetic similarities among 84 E.sibiricus accessions based on SRAP data

基于84份種質(zhì)GS矩陣的主向量分析(PcoA)的結(jié)果表明，第1和第2主向量分別可以解釋16.7%和5.8%的遺傳變異。依據(jù)圖4上各種質(zhì)間的空間關(guān)系，可以直觀地看出84份材料被明顯劃分成兩大組，其中青藏高原組又可劃分成3個亞組。這與UPGMA聚類結(jié)果保持一致。

圖3 基于SRAP數(shù)據(jù)利用UPGMA法獲得的老芒麥種質(zhì)的聚類樹形圖Fig.3 Dendrogram of E.sibiricus accessions based on SRAP data using UPGMA method

圖4 基于SRAP數(shù)據(jù)描述84份老芒麥種質(zhì)間遺傳關(guān)系的主向量分析Fig.4 Two-dimensional principal coordinate analysis depicting genetic relationships among 84 E.sibiricus accessions based on SRAP data

2.4 老芒麥地理類群的遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)采集地及其生態(tài)條件的差異，可以將供試種質(zhì)劃分為四大類群，即青藏高原、新疆、蒙古和俄羅斯類群?；跀U增帶(記為1的帶)和無效帶(記為0的帶)的頻率，對群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。AMOVA分析結(jié)果顯示:在總的遺傳變異中有79.62%發(fā)生在類群內(nèi)，有20.38%發(fā)生在類群間(ΦST=0.204)，群體間和群體內(nèi)的變異均為極顯著(P ＜0.0001)(表4)。

表4 4個老芒麥地理類群的分子方差分析(AMOVA)Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA)of four germplasm groups of E.sibiricus

2.5 老芒麥地理類群的聚類分析

基于AMOVA分析，可以得到類群間兩兩比較的ΦST值，它可以代表標(biāo)準(zhǔn)化的類群間遺傳距離(pairwise ΦSTdistance)(表5)。青藏高原類群與其他類群間的遺傳距離均比較大，而剩余3個類群間的遺傳距離比較小。類群間成對ΦST的變幅為0.0371(蒙古類群與俄羅斯類群間)～0.3547(蒙古類群與青藏高原類群間)。為更好地了解各類群間的遺傳關(guān)系，利用表5中的ΦST距離，進(jìn)行UPGMA聚類分析(圖5)。4個地理群被明顯劃分成兩支，一支為青藏高原類群，另一支包括蒙古、俄羅斯和新疆類群。青藏高原類群明顯區(qū)別于其他3個類群，這與對84份種質(zhì)的UPGMA聚類結(jié)果一致(圖3)。

圖5 基于AMOVA獲得的遺傳距離對4個老芒麥地理類群的UPGMA聚類Fig.5 UPGMA clustering of four geographic groups of E.sibiricus using genetic distances generated from AMOVA

3 討論

3.1 SRAP標(biāo)記的多態(tài)性和變異

形態(tài)－農(nóng)藝性狀和生化標(biāo)記(同工酶和種子貯藏蛋白)是評價植物種內(nèi)遺傳多樣性的常用手段［7，27-30］。由于不受環(huán)境影響、不受限于植物的發(fā)育階段，分子標(biāo)記目前已成為遺傳多樣性評價的強有力的主流研究手段。雖然目前有關(guān)利用分子標(biāo)記研究老芒麥種質(zhì)遺傳變異的報道很少，但RAPD、SSR、AFLP、PCR－RFLP等DNA分子標(biāo)記已廣泛用作披堿草屬植物的群體遺傳結(jié)構(gòu)和種間系統(tǒng)進(jìn)化研究［31-34］。SRAP標(biāo)記綜合RAPD標(biāo)記的簡便性和AFLP標(biāo)記的高多態(tài)性和穩(wěn)定性于一身，其上下游通用引物可以搭配使用，極大地提高了引物的利用效率，是一種進(jìn)行遺傳多樣性評價、品種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究的有效工具［9，13］。本研究得到的老芒麥種質(zhì)的SRAP多態(tài)性比率(PP)為 60.24%，低于已報道的禾本科植物野牛草(95%)［13］和鴨茅(Dactylis glomerata)(84.4%)［35］，而且也低于對青藏高原地區(qū)老芒麥SRAP研究的結(jié)果(86.48%)［36］。本研究利用23個引物組合共擴增出337條帶，其中多態(tài)性帶203條，平均每個引物組合擴增多態(tài)性帶8.8條，說明SRAP的擴增產(chǎn)率較高，非常適合對大規(guī)模種質(zhì)的遺傳變異檢測。由于SRAP可以采用更加靈敏的聚丙烯酰胺凝膠銀染或熒光標(biāo)記來檢測擴增帶，而本實驗采用的是較為簡便的瓊脂糖檢測法，這可能是本研究所得的多態(tài)性比率較低的部分原因。

84份老芒麥種質(zhì)間的平均遺傳相似系數(shù)(GS)為0.865，表明供試材料間具有較近的遺傳關(guān)系，這很可能與老芒麥的繁育方式相關(guān)。一般來說，相對于異花授粉和常異花授粉植物而言，自花授粉植物具有較高的群體間遺傳變異和較低的群體內(nèi)遺傳變異［37］。由于老芒麥存在較高的異交率，并非嚴(yán)格的自花授粉植物，屬于常異花授粉植物，所以每份種質(zhì)都可以看作是一個內(nèi)部存在較高變異的小群體，而本實驗采用的是混合單株提取DNA法(bulked DNA)，可能會掩蓋種質(zhì)內(nèi)的遺傳變異，降低決定種質(zhì)間遺傳關(guān)系的多態(tài)性帶的數(shù)目;加上種質(zhì)間在繁殖后代過程中存在一定的基因流(花粉流)［38］，這兩種因素可能會在一定程度上降低種質(zhì)間的遺傳差異，導(dǎo)致種質(zhì)間較高平均GS值的出現(xiàn)。根據(jù)地理來源的不同，將供試種質(zhì)劃分為四大地理類群。地理隔離、生態(tài)隔離和繁殖隔離會極大地影響植物的種內(nèi)遺傳多樣性［39］。所以青藏高原類群與其他3個類群種質(zhì)間平均GS值均較小，其原因可能是青藏高原與其他三地區(qū)的生態(tài)地理環(huán)境存在的巨大差異所致。

本研究運用AMOVA分析的結(jié)果表明:老芒麥地理類群內(nèi)的遺傳變異占總變異的79.62%，類群間的遺傳變異占總變異的20.38%，基于Shannon指數(shù)的分析結(jié)果與AMOVA分析結(jié)果非常接近。另外在4個地理類群中，青藏高原類群具有最高的Shannon多樣性(Ho=0.2398)。這表明進(jìn)行老芒麥遺傳資源的挖掘利用時，應(yīng)更多地重視本地優(yōu)異資源特別是青藏高原地區(qū)資源的收集、保護(hù)及隔離繁種。

3.2 供試種質(zhì)間及其地理類群間的遺傳關(guān)系

根據(jù)表現(xiàn)所有供試種質(zhì)間遺傳關(guān)系的聚類樹形圖和主向量空間分布圖來看，各種質(zhì)的聚類分布與地理來源有較強的關(guān)系［40］。種質(zhì)的地理來源代表了不同的宏觀生態(tài)環(huán)境，而這些不同的生態(tài)環(huán)境條件是造成種質(zhì)間的遺傳變異的主要因素［41］。本研究供試種質(zhì)被分成兩大類的原因，可能主要依賴于青藏高原種質(zhì)的特有生態(tài)地理適應(yīng)性。由于青藏高原的高海拔及它被喀喇昆侖山、阿爾金山和祁連山等著名高山與其他種質(zhì)的來源地區(qū)隔離開來［42］，造成其植物種質(zhì)可能具有特定的生態(tài)地理適應(yīng)性。需要注意的是，來自于新疆、蒙古和俄羅斯的種質(zhì)并沒有按地理來源被清晰的分開，可能與這3個國家或地區(qū)接壤且并無明顯生態(tài)條件差別有關(guān)。另外，種質(zhì)繁殖后代過程中的遺傳交換可能會加劇種質(zhì)間的遺傳相似性。同樣，基于AMOVA分析產(chǎn)生的類群間ΦST值的聚類分析也反映了相似的實驗結(jié)果。雖然AMOVA分析表明地理類群間的變異僅占總變異的20.38%，但達(dá)到了極顯著水平，這從另一個側(cè)面反映了青藏高原種質(zhì)類群與其他類群間存在較大的遺傳差異。本結(jié)果與Chen等［43］、陳智華等［44］和苗佳敏等［45］對垂穗披堿草(Elymus nutans)遺傳多樣性的研究結(jié)果一致，即青藏高原與其他地區(qū)的種質(zhì)材料存在明顯的遺傳分化。特別提及的是，由于AMOVA可以計算無法估計是否處于Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)或人為劃分的植物類群或群體間的ΦST值作為其遺傳距離，因而在評價類似植物群體間和群體內(nèi)的遺傳關(guān)系時非常有效［46］。如果采用POPGENE等軟件強行基于H-W遺傳平衡來計算人為劃分群體(如地理類群)的遺傳分化，可能存在較大誤差。

本研究的結(jié)果表明SRAP是評價老芒麥種質(zhì)資源遺傳變異的有效手段。今后應(yīng)增加利用SSR等標(biāo)記手段以檢測非編碼區(qū)的遺傳變異，綜合評價現(xiàn)有老芒麥種質(zhì)在全基因組水平上的遺傳多樣性，為種質(zhì)保護(hù)、利用和品種選育提供有益的信息。

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