馬纓杜鵑不同完整性居群遺傳多樣性的AFLP分析

縱 丹 ，員 濤 ，李佳蔓 ，周安佩 ，胡世俊 ，何承忠 ,，

（西南林業(yè)大學(xué) a. 西南山地森林資源保護(hù)與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650224）

馬纓杜鵑不同完整性居群遺傳多樣性的AFLP分析

縱 丹a，員 濤a，李佳蔓a，周安佩a，胡世俊b，何承忠a,b，

（西南林業(yè)大學(xué) a. 西南山地森林資源保護(hù)與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b. 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650224）

采用選擇性擴(kuò)增片段多態(tài)性（AFLP）技術(shù)對馬纓杜鵑5個不同完整性居群的遺傳多樣性進(jìn)行檢測和分析。結(jié)果表明：篩選出的7對引物組合共擴(kuò)增出527條帶，其中多態(tài)帶382條，多態(tài)帶百分率為72.49%；5個居群間的多態(tài)性百分率在52.23%～69.64%之間，居群平均多態(tài)性百分率為57.80%；Nei’s基因多樣性變化范圍在0.113 9～0.173 8之間，Shannon信息指數(shù)為0.186 8～0.277 7；居群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.168 8，表明83.12%遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，居群間基因流為2.462 4，足以維持居群間現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)；AMOVA分析結(jié)果表明，18.34%的遺傳變異存在于居群間，81.66%的遺傳變異存在于居群內(nèi)；基于UPGMA聚類結(jié)果，可將5個馬纓杜鵑居群分為3組，紫溪山和板凳山居群、馬雄山和小營地居群之間各為一組，老灣地居群獨(dú)自一組。研究表明，該物種有些居群雖遭受嚴(yán)重的人為破壞，但居群的遺傳多樣性仍然較高。

馬纓杜鵑；居群；AFLP標(biāo)記；遺傳多樣性

馬纓杜鵑Rhododendron delavayiFranch又名馬纓花，是杜鵑花科常綠杜鵑亞屬植物，直立小喬木或灌木，高3～8 m，最高可達(dá)到12 m以上，喜酸性土壤[1-2]，主要分布于云南、貴州等較高海拔的地區(qū)，有耐寒、耐旱、花色鮮艷、花期長等特性，可藥用，具有較高的觀賞和藥用價值[3-4]。目前國外對杜鵑花的宏觀和微觀研究相對較多，在分子水平主要是對同種不同環(huán)境的居群的分析[5]、耐寒基因研究[6]、轉(zhuǎn)基因研究[7]和分子遺傳圖譜的構(gòu)建[8]等。國內(nèi)對杜鵑屬植物的研究主要包括兩個方面，一是對杜鵑屬植物分類學(xué)的基礎(chǔ)性研究，另一方面是與應(yīng)用有關(guān)的組培育種馴化和生理生化研究[9]，如對馬纓杜鵑種子的萌發(fā)以及播種苗的生長規(guī)律[2,10]、馬纓杜鵑種子萌發(fā)生長的最佳生理?xiàng)l件[4]、不同浸種方式對4個居群的馬纓杜鵑種子發(fā)芽率影響和組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究[11-12]等。

近年來，隨著人類活動的加劇，物種賴以生存的生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重的破壞，而生境的破壞和片段化又以更微妙的方式影響物種的生存，不僅對生物性和物理性的生態(tài)系統(tǒng)造成干擾[13]，也嚴(yán)重影響物種的遺傳結(jié)構(gòu)[14-15]。因此，生境破壞后的物種群體遺傳多樣性已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。張文標(biāo)等[16]采用RAPD技術(shù)對不同生境夏臘梅的群體遺傳多樣性進(jìn)行了分析；胡世俊等[17]分析了生境破碎對縉云衛(wèi)矛種群遺傳多樣性的影響。當(dāng)前，馬纓杜鵑被廣泛應(yīng)用于園林綠化之中，但所用苗木基本來自于采挖野生資源，對馬纓杜鵑種群結(jié)構(gòu)造成了極大的破壞。而采用分子標(biāo)記技術(shù)開展馬纓杜鵑的相關(guān)研究報道較少，僅有趙喜華等[18]采用RAPD技術(shù)探討了9種常綠杜鵑亞屬和2種馬纓花亞屬杜鵑的種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)位置。

AFLP作為RAPD和RFLP相結(jié)合的一種分子標(biāo)記技術(shù)，不僅具有RAPD的隨機(jī)性和方便性，而且具有RFLP的專一性和可靠性[19]。本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對分布于云南境內(nèi)5個馬纓杜鵑不同完整性居群的遺傳多樣性進(jìn)行檢測，旨在了解這些不同破壞程度的馬纓杜鵑自然居群的遺傳變異及遺傳結(jié)構(gòu)特征，并探討在當(dāng)前較嚴(yán)重的生境干擾情況下，該物種的遺傳多樣性如何變化，為更好地保護(hù)其遺傳多樣性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料分別采集于云南省楚雄市紫溪山、板凳山和曲靖市馬雄山、小營地、老灣地5個馬纓杜鵑的自然分布居群。每個居群確定5 km×5 km大小的取樣范圍，按照隨機(jī)取樣的原則，從中心點(diǎn)開始向四個方向每隔250 m采集1份，將采集的葉片用硅膠干燥，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。每居群的樣本數(shù)及居群生境與結(jié)構(gòu)完整性概況見表1。

表1 馬纓杜鵑5個居群樣本數(shù)及居群概況Table 1 Samples and introduction of 5 populations of R. delavayi

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

將133份樣本的葉片磨碎后，使用改良的SDS法依照標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿流程提取總DNA[20]。提取后的總DNA采用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，-20℃保存，備用。

1.2.2 AFLP分析

AFLP分析的基本過程參照Vos等[21]的方法進(jìn)行。采用EcoRⅠ+MesⅠ限制性內(nèi)切酶組合進(jìn)行基因組DNA的雙酶切，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)采用EcoRⅠ+00/MesⅠ+00的引物組合，選擇性擴(kuò)增反應(yīng)采用引物組合EcoRⅠ+3/MesⅠ+3，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100TMThermal PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物加入1/3體積的雙指示劑短暫離心后，95 ℃變性5 min，取出后立即放入碎冰中，取樣6 μL于已預(yù)電泳30 min的6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，其功率恒定為70 W，時間約2 h，電泳產(chǎn)物采用銀染法[22]進(jìn)行條帶的顯色反應(yīng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

依據(jù)AFLP指紋圖譜上同一位點(diǎn)條帶的有或無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，選擇清晰穩(wěn)定的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，形成0/1矩陣。采用POPGENE version 1.32軟件對5個居群共133份馬纓杜鵑樣本進(jìn)行相關(guān)遺傳變異指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算多態(tài)性標(biāo)記百分率、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性（H）、Shannon信息指數(shù)（I）。采用AMOVA 1.55軟件[23]對居群間和居群內(nèi)的分子變異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引物組合的AFLP擴(kuò)增條帶多態(tài)性分析

采用篩選出的7對電泳條帶清晰、重復(fù)性好的引物組合對供試樣品進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出527條條帶，其中多態(tài)性條帶382條，多態(tài)帶百分率為72.49%，有效標(biāo)記的長度范圍為75～520 bp（見表2）。每對引物組合產(chǎn)生的總帶數(shù)為43～102條，多態(tài)性條帶29～78條，平均每對引物擴(kuò)增總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶分別為75.29條和54.57條。在7對選擇性擴(kuò)增引物組合中，多態(tài)性帶數(shù)最多的是78條，出現(xiàn)在引物組合E32-M40的擴(kuò)增結(jié)果中，最少的是由引物組合E58-M64擴(kuò)增得到的29條。由此可知，5個居群的133份馬纓杜鵑樣本之間存在著一定的遺傳差異。

表2 7對AFLP選擇性引物組合擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplified results of AFLP makers by 7 selective primer combinations

2.2 不同居群馬纓杜鵑遺傳多樣性指標(biāo)分析

對馬纓杜鵑的遺傳多樣性分析（見表3）表明，不同居群所擴(kuò)增的多態(tài)性條帶在270～367條之間，多態(tài)性位點(diǎn)百分率相差不大，其中小營地居群多態(tài)位點(diǎn)百分率最高，為69.64%，說明小營地居群的馬纓杜鵑具有較高的遺傳多樣性。而最低的是紫溪山居群，占52.23%，其次為馬雄山居群（52.37%）、老灣地居群（56.55%）和板凳山居群（59.20%）。

表3 馬纓杜鵑5個居群遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of 5 populations of R. delavayi

在居群水平上，Nei’s基因多樣性變化范圍在0.113 9～0.173 8之間，總體為0.162 9。其中小營地居群在觀測等位基因數(shù)（1.696 4）、有效等位基因數(shù)（1.269 4）、Nei’s基因多樣性（0.173 8）和Shannon信息指數(shù)（0.277 7）均表現(xiàn)出最高，而馬雄山居群的多態(tài)性百分率（52.37%）和觀測等位基因數(shù)（1.523 7）雖略高于紫溪山居群（52.23%和1.512 3），但其Nei’s基因多樣性和Shannon信息指數(shù)（0.113 9和0.186 8）都要低于紫溪山居群（0.120 3和0.193 5）。5個居群的Shannon信息指數(shù)與Nei’s基因多樣性變化趨勢基本保持一致，也進(jìn)一步表明來自不同地區(qū)的5個馬纓杜鵑居群間存在一定的遺傳差異。5個居群之間的基因流為2.462 4（＞1），總基因多樣性為0.169 2，居群內(nèi)的基因多樣性為0.140 7，居群間基因分化系數(shù)為0.168 8，表明馬纓杜鵑總遺傳變異的16.88%來自于居群間，而83.12%來自于居群內(nèi)，即居群間的遺傳分化較居群內(nèi)小。

2.3 遺傳差異的分子方差分析

AMOVA分析結(jié)果表明，5個居群間的遺傳變異分量為11.302 8，占總變異的18.34%；而居群內(nèi)的遺傳變異分量為50.340 7，占總變異的81.66%，居群間的差異不顯著（P=0.183）（見表4），說明馬纓杜鵑的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)不同個體之間，這與POPGEN分析結(jié)果相一致。

2.4 聚類分析

依據(jù)POPGENE的分析結(jié)果（見表5），5個居群之間的遺傳距離變化范圍在0.079 0～0.011 0之間，平均為0.042 5。紫溪山居群和老灣地居群之間的遺傳距離最大，為0.079 0，表明紫溪山居群和老灣地居群之間具有較大的遺傳差異，紫溪山居群和板凳山居群遺傳距離最小（0.011 0）。基于5個居群之間的遺傳距離，采用非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建了聚類分析樹狀圖（見圖1）。當(dāng)遺傳距離為0.01時，可將5個居群劃分為3類，第1類包括紫溪山和板凳山2個居群，馬雄山和小營地居群組成第2類，老灣地居群單獨(dú)聚為第3類。聚類結(jié)果與馬纓杜鵑居群的地理分布位置基本一致。

表5 馬纓杜鵑5個居群間的遺傳距離Table 5 Genetic distance of 5 populations of R. delavayi

圖1 馬纓杜鵑5個居群的UPGMA聚類Fig. 1 Dendrogram of 5 populations of Rhododendron delavayi

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性是生物在長期進(jìn)化過程中形成的一種自然屬性，而這種屬性不僅體現(xiàn)為物種居群間和居群內(nèi)的差異，而且也體現(xiàn)在不同的個體之間，它是物種的種群和個體遺傳變異的總和[24]。就植物而言，影響其遺傳多樣性高低的因素有很多，包括物種的交配形式、基因流、種群的數(shù)量和大小、人為干擾等[25]，但在植物遺傳多樣性形成過程中，也有可能只有一種因素起主導(dǎo)作用[26-27]。

Hamrick和Godt[27]通過對449種植物的653例等位酶遺傳變異進(jìn)行研究，在綜合分析的8個主要生態(tài)和生活史等特性中，認(rèn)為在居群水平上，交配系統(tǒng)對植物遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)影響最大，它控制基因由配子體在兩個世代間的傳遞與延續(xù)。從某種意義上說，在其它條件基本一致的情況下，植物居群具有什么樣的遺傳結(jié)構(gòu)將取決于自交和異交所占的比重[28]，在自交種的遺傳變異中，平均有51%存在于居群之間（遺傳分化系數(shù)為0.510），而混交、動物傳播或異交的植物類群，其遺傳變異主要在居群內(nèi)，其遺傳分化系數(shù)分別為0.216和0.197[26]。楊佳等[29]通過對已知交配形式以自交為主的裸蕓香居群進(jìn)行研究，其結(jié)果中的遺傳分化系數(shù)為0.509 6。馬麗娟等[30]在對以異交為主的野生杏遺傳多樣性的研究結(jié)果中表明，遺傳分化系數(shù)為0.172 0。這些研究結(jié)果均與Hamrick和Godt的結(jié)論一致。在同屬異種的其它杜鵑遺傳多樣性研究中，趙芯等[31]用ISSR標(biāo)記對浙江省大明山4個麂角杜鵑種群的遺傳多樣性研究結(jié)果顯示，其多態(tài)位點(diǎn)百分率為88.07%，遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。金則新等[32]采用ISSR技術(shù)對5個云錦杜鵑居群的研究結(jié)果表明，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為88.24%，其中40.03%變異存在于居群間，59.97%存在于居群內(nèi)。本研究結(jié)果表明，馬纓杜鵑具有較高的遺傳多樣性（多態(tài)性百分率為72.49%，總基因多樣性為0.169 2），其遺傳分化系數(shù)為0.168 8，與異交植物類群遺傳分化系數(shù)（0.197）接近。馬纓杜鵑花色艷麗，能夠吸引大量的傳粉昆蟲，異交可能在馬纓杜鵑交配系統(tǒng)中占有相當(dāng)比例。而居群間遺傳變異僅占總變異的18.34%，居群內(nèi)遺傳變異占總變異的81.66%，說明馬纓杜鵑的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)不同個體之間。該結(jié)果與杜鵑屬麂角杜鵑、云錦杜鵑的遺傳結(jié)構(gòu)相同。因此，在馬纓杜鵑種質(zhì)資源收集及保存時，可以減少采樣居群的數(shù)量，但在居群內(nèi)的取樣數(shù)量要適當(dāng)增加。

基因的相互交流使得居群內(nèi)的遺傳變異升高，減少了居群間的遺傳分化，這種表現(xiàn)在居群間和居群內(nèi)的遺傳物質(zhì)交流稱為基因流[33]。Slatkin[34]和Hamrick等[27]認(rèn)為，若基因流＞1，基因流足以抵制遺傳漂變作用，防止居群分化發(fā)生，維持居群現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)；若基因流＜1，就意味著居群間基因流不足以防止居群間的遺傳分化。本研究的結(jié)果顯示馬纓杜鵑居群間的基因流為2.462 4，表明馬纓杜鵑居群間的基因流足以維持其現(xiàn)有的遺傳結(jié)構(gòu)，而異交植物的基因流明顯大于自交植物[27]，這也進(jìn)一步說明了馬纓杜鵑的交配形式主要為異交。

隨著人類活動的增加，人為干擾對遺傳多樣性造成嚴(yán)重的影響，而生境破壞和片段化對生物多樣性尤其是遺傳多樣性的影響更為突出[35]。生境破碎化會增加居群間遺傳分化，降低居群內(nèi)遺傳變異，并且影響居群長期及短期的生存力[18]。王崢峰等[36]通過對南亞熱帶厚殼桂的研究結(jié)果表明：森林的破碎化使種群遺傳多樣性降低，種群間基因流受阻。胡世俊等[18]對生境破碎的縉云衛(wèi)矛研究結(jié)果顯示：生境破碎不利于其居群間的基因流，導(dǎo)致小居群遺傳多樣性的喪失。王崢峰等[37]認(rèn)為人為干擾使得種群個體數(shù)量減少，小種群具有較少的遺傳變異，導(dǎo)致種群遺傳多樣性喪失，引起近交衰退，并影響到種群后代的適應(yīng)性。此外，人為干擾等外部因素并不會直接影響等位基因的數(shù)目與頻率，而是通過交配形式、基因流等內(nèi)部因素間接來改變[27,38-40]。本研究中，小營地居群和老灣地居群的完整性均低于紫溪山居群和馬雄山居群，但這2個居群的遺傳多樣性指標(biāo)均高于紫溪山居群和馬雄山居群，這表明小營地居群和老灣地居群雖然受人為干擾最為嚴(yán)重，居群的完整性較差，但這些外部因素均未能有效地影響其遺傳多樣性?？赡艿脑蚴窃摼尤菏芨蓴_的歷史較短，或居群屬于大種群，在發(fā)展歷史上就保持了較高遺傳多樣性，因此，短期的干擾并不會立即導(dǎo)致遺傳多樣性的明顯下降。

通過對馬纓杜鵑不同完整性居群遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，馬纓杜鵑遺傳多樣性主要存在于居群內(nèi)不同個體之間。雖然一些受干擾較嚴(yán)重的居群的遺傳多樣性目前依然較高，但人類若不停止生境破壞、采挖、砍伐、放牧等行為，一些較大的種群也會急劇減小，加劇遺傳多樣性的喪失，進(jìn)一步導(dǎo)致近交、繁殖障礙，降低馬纓杜鵑種群的適應(yīng)能力。因此要對受干擾較嚴(yán)重的馬纓杜鵑種群加以就地保護(hù)，防止生境的進(jìn)一步破壞，維持種群的數(shù)量，才能長期的保存這一具有重要觀賞價值的物種。

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Analysis on genetic diversity of different integrity population ofRhododendron delavayiby AFLP markers

ZONG Dana, YUN Taoa, LI Jia-mana, ZHOU An-peia, HU Shi-junb, HE Cheng-zhonga,b
(a. Key Lab. for Forest Resources Conservation and Use in Southwest Mountains of China co-constructed by State Education Ministry and Yunan Province; b. Key Lab. of Biodiversity Conservation in Southwest China Supported by State Forestry Administration,Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

The genetic diversity of fi ve different integrity populations ofRhododendron delavayiwere investigated and analyzed by using the technology of amplif i ed fragment length polymorphism (AFLP). Seven pairs of AFLP primer combinations were selected and from these 527 AFLP fragments were obtained, of which 382 fragments were polymorphic, accounting for 72.49%. The percentage of polymorphic of 5 populations varied from 52.23% to 69.64%, and the average percentage of polymorphic fragments was 57.80%.Nei’s gene diversity varied from 0.113 9 to 0.173 8, and Shannon information index varied from 0.186 8 to 0.277 7. In addition, the gene differentiation coeff i cient (Gst) was 0.186 8, which showed that 83.12% genetic diversities existed within the populations. Nm was 2.462 4, which indicated that the gene fl ow was enough to maintain the current genetic structure. Analysis of molecular variance(AMOVA) implied that the genetic variation among populations was 18.34%, while 81.66% of the genetic variation existed within populations. The five populations could be divided into three groups based on the results of UPGMA. Zixishan and Bandengshan populations, Maxiongshan, and Xiaoyingdi population each became a group, while Laowandi population was alone as a group. The fi ndings showed that although some populations were disturbed by human being but also held higher genetic diversity.

Rhododendron delavayi; population; AFLP markers; genetic diversity

S759.95

A

1673-923X(2014)09-0117-06

2013-12-10

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（201104076）；云南省中青年學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目（2012HB021）

縱 丹（1988- ），女，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究

何承忠（1970- ），男，甘肅民勤人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事林木遺傳育種與分子生物學(xué)研究；

E-mail: hcz70@163.com

[本文編校：謝榮秀]