人參皂苷Rh2的C—20構(gòu)型確證

[摘要] 目的 確證人參次苷H主成分人參皂苷Rh2的結(jié)構(gòu)與空間構(gòu)型。 方法 單晶X-射線衍射，HPLC、13C-NMR比較與其C-20的R型異構(gòu)體的差異。 結(jié)果 HPLC保留時(shí)間顯示人參皂苷H中主成分人參皂苷Rh2與酸降解R型異構(gòu)體不同，二者是兩種不同成分；13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的20（S）-人參皂苷Rh2一致。單晶X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析也證實(shí)其為20（S）人參皂苷Rh2。 結(jié)論 人參次苷H主成分為20（S）-人參皂苷Rh2。

[關(guān)鍵詞] 20（S）-人參皂苷Rh2；差向異構(gòu)體；單晶X-射線衍射

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0050-03

人參次苷H是以西洋參葉為起始原料經(jīng)提取、堿降解、色譜分離提純后得到的一組富含次級人參皂苷Rh2、Rh1和Rk2的原料藥，其主要成分是20（S）人參皂苷Rh2，用于腫瘤治療。人參皂苷Rh2 的C-20存在R、S型兩種差向異構(gòu)，抗腫瘤作用S型強(qiáng)于R型，具有構(gòu)效效應(yīng)[1-4]。西洋參莖葉中含有的達(dá)瑪烷型皂苷其天然結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)為20（S）構(gòu)型，如果用鹽酸等強(qiáng)酸水解，C-20上的甲基和羥基發(fā)生差向異構(gòu)，轉(zhuǎn)變?yōu)?0（R）型。如果用堿水解，則保持20（S）構(gòu)型不變[5]。我們已完成了西洋參莖葉為起始原料制備西洋參總皂苷，再經(jīng)堿降解的半合成衍生化大規(guī)模制備人參次苷H原料工藝，因?yàn)椴捎脡A降解法，理論上其主成分人參皂苷Rh2應(yīng)該是20（S）構(gòu)型。

從人參次苷H原料中分離得到人參皂苷Rh2的單體后，對其理化性質(zhì)進(jìn)行檢查，熔點(diǎn)218～220℃，難溶于水，微溶于乙酸乙酯、三氯甲烷，可溶于乙醇、甲醇；Molish反應(yīng)呈陽性[6]；比旋度為[α]22D。24.8（c 0.9，MeOH）。還采用UV、IR、MS、1H-和13C-NMR等譜學(xué)分析方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，與文獻(xiàn)報(bào)道的20（S）-人參皂苷Rh2一致。為進(jìn)一步佐證對其C-20化學(xué)構(gòu)型的推論，我們對獲得的人參皂苷Rh2進(jìn)行了單晶培養(yǎng)，通過X-射線衍射分析，最終確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1材料與方法

1.1儀器與材料

西洋參總皂苷、人參次苷H、人參皂苷Rh2對照品，山東綠葉制藥有限公司自制；水（H2O）為山東綠葉制藥有限公司所制純化水；甲醇（MeOH）、硫酸、乙酸乙酯（EtOAc）、磷酸、三氯甲烷（CHCl3）、95%乙醇、無水乙醇（EtOH）等均為分析純；乙腈為色譜純；色譜硅膠（200-300目、100-200目，煙臺(tái)化工研究所）。單晶X-射線衍射儀：日本MAC DIP-2030K； Agilent1100高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，discovery C18柱；Unity-Plus 400型NMR儀（美國瓦里安公司）。

1.2 方法

1.2.1 人參次苷H主成分的分離及單晶培養(yǎng) 人參次苷H原料經(jīng)硅膠柱色譜分離，MeOH-H2O（4：1）重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶。取白色針狀結(jié)晶用適量MeOH加熱溶解，再加入適量CHCl3、H2O，室溫下放置，使其緩緩長出單晶，單晶呈無色透明塊狀。

1.2.2 制備人參次苷H主成分的C-20差向異構(gòu)體 取西洋參莖葉總皂苷40 g溶于1 000 mL 95% EtOH水溶液中，加入10%濃硫酸水溶液1 000 mL，80℃加熱降解4 h。降解液冷卻至室溫后用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7，減壓蒸出EtOH，過濾得白色沉淀。酸降解物經(jīng)硅膠柱色譜，EtOAc：EtOH=9：1洗脫，晶體再用MeOH-H2O（4：1）重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶。

1.2.3 HPLC分析 精密稱取主成分與酸降解物樣品，50%乙腈溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別量取此2個(gè)組份液體供試品及其它們的等體積混合樣20 μL，注入HPLC儀，固定相為十八烷基硅烷鍵和硅膠；流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸（65：35：0.125，v/v/v），檢測波長203 nm，流速1 mL/min。比較兩個(gè)組份HPLC圖譜的保留時(shí)間。

1.2.4 13C-NMR分析 主成分與其差向異構(gòu)體樣品分別進(jìn)行13C-NMR分析，溶劑為氘代吡啶（C5D5N）。

1.2.5 單晶結(jié)構(gòu)測定 （1）衍射實(shí)驗(yàn)：衍射用主成分晶體樣品呈無色透明塊狀，大小為0.12×0.15×0.15 mm，屬正交晶系，空間點(diǎn)群P212121，晶胞參數(shù)：a=10.775（1），b=12.008（1），c=33.360（1）■。晶胞體積V=4316.3（6）■3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z=4。用MAC DIP-2030面探測儀收集衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，Mokα輻射掃描，石墨單色器，晶體與IP板距離d=100 mm，管壓50 KV，管流70 mA，ω掃描，最大2θ角為50.0°，掃描范圍0～180°，回?cái)[角為3°，掃描速度1.2°/min，每個(gè)畫面掃描2次，共計(jì)攝取60幅圖像，獨(dú)立衍射點(diǎn)為4674個(gè)，可觀察點(diǎn)（|F|2≥3σ|F|2）為3753個(gè)。

（2）結(jié)構(gòu)計(jì)算：在微機(jī)上用直接法（shelxs86）解析晶體結(jié)構(gòu)，獲得32個(gè)非氫原子位置。交迭使用最小二乘法和差值Fourier法獲得其他非氫原子位置，最小二乘法修正結(jié)構(gòu)參數(shù)和判別原子種類，幾何計(jì)算法和差值Fourier法獲得全部氫原子位置，最終可靠因子Rf=0.068，Rw=0.067（w=1/σ|F|2）。

3 分析與討論

3.1 HPLC分析

從人參次苷H中分離得到的主成分保留時(shí)間為11.84 min；酸降解西洋參總皂苷得到的差向異構(gòu)體保留時(shí)間為12.64 min；此外，混合樣中二個(gè)峰的分離度好，保留時(shí)間與單獨(dú)進(jìn)樣一致，說明的確是2個(gè)不同的化合物。

3.2 13C-NMR譜數(shù)據(jù)對20位碳S構(gòu)型推定

將主成分的13C-NMR譜從C-1→ C-30的化學(xué)位移數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的20（S）-原人參二醇[20（S）-PPD）]比較，除了C-3的信號δ 88.8明顯向低場位移約10 ppm外，其他信號基本一致；而δ 88.8信號正是文獻(xiàn)報(bào)道[9]20（S）-PPD的C-3成苷后的苷化位移信號，說明主成分化合物是糖基與苷元結(jié)構(gòu)相同的20（S）型PPD在C-3上成苷而得。

比較主成分化合物與其酸降解差向異構(gòu)體樣品的13C-NMR數(shù)據(jù)，可以看出C-17，C-21，C-22上各自的化學(xué)位移之差（δ酸降解物-δ主成分）分別為-4.1 ppm，-4.1 ppm和8.1 ppm，符合藤榮偉[10]報(bào)道Tanaka總結(jié)的原人參二醇型皂苷C-20差向異構(gòu)體13C-NMR化學(xué)位移規(guī)律，證明了它們互為C-20的差向異構(gòu)體；其次說明了化學(xué)位移C-17，C-21相對在高場、C-22化學(xué)位移相對在低場的化合物是R構(gòu)型，反之是S構(gòu)型。主成分化合物實(shí)測數(shù)據(jù)，C-17，C-21相對在低場，C-22相對在高場，說明是S型。

人參皂苷Rh2為已知結(jié)構(gòu)化合物，將其13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較，可以看出，從人參次苷H中分離得到的主成分與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的20（S）-人參皂苷Rh2的數(shù)據(jù)一致，而以西洋參莖葉總皂苷經(jīng)酸降解后分離得到的主成分的差向異構(gòu)產(chǎn)物與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的20（R）-人參皂苷Rh2的一致。

3.3 單晶衍射數(shù)據(jù)對20位碳S構(gòu)型的推定

從X-射線衍射立體結(jié)構(gòu)投影圖可以看出空間排布，C-20手性碳所連的4個(gè)基團(tuán)按優(yōu)先性大小順序規(guī)則排列：羥基>苷元母核>C-22側(cè)鏈>C-21甲基；以C-20手性碳為中心畫出楔形式（圖6）：

將優(yōu)先順序最小的C-21甲基放在離眼睛最遠(yuǎn)處看其他三個(gè)基團(tuán)，按從大到小的旋轉(zhuǎn)方向是逆時(shí)針，說明C-20手性碳是S構(gòu)型。

4 結(jié)論

本研究首次制得20（S）-人參皂苷Rh2單晶，采用X-射線單晶衍射結(jié)合13C-NMR分析，均證明人參次苷H主成分人參皂苷Rh2的C-20構(gòu)型為S型。

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（收稿日期：2013-03-14）