miR—19影響人乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的研究

[摘要] 目的 探討miR-19對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。 方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF7細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染pre-miR-19和miR-19抑制物，然后應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)MCF7細(xì)胞活性和增殖情況，應(yīng)用transwell小室法測(cè)定MCF7細(xì)胞遷移和侵襲能力改變。 結(jié)果 pre-miR-19轉(zhuǎn)染組的MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率下降，細(xì)胞活性和增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)；miR-19抑制物轉(zhuǎn)染組的MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率增高，細(xì)胞活性和增殖能力下降，細(xì)胞遷移侵襲能力減弱。 結(jié)論 在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-19發(fā)揮原癌基因作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

[關(guān)鍵詞] 人乳腺癌；miR-19；增殖；遷移

[中圖分類號(hào)] R730 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）30-0040-02

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，近年來我國(guó)乳腺癌發(fā)病呈上升趨勢(shì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的多種基因表達(dá)異常，其中包括多種非蛋白編碼微小RNA（micro RNA，miR）基因異常。miR基因的表達(dá)產(chǎn)物為miR分子，由18～25個(gè)核苷酸組成。miR基因參與細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育等重要生命過程，對(duì)一些疾病的發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用[2]。有報(bào)道稱，乳腺癌患者的miR-17-92家族中的多種基因表達(dá)異常。miR-19基因是該家族基因的一個(gè)重要成員。關(guān)于miR-19基因與乳腺癌發(fā)病的作用，國(guó)內(nèi)目前報(bào)道較少。本文探討miR-19基因?qū)θ巳橄侔㎝CF7細(xì)胞株增殖、遷移以及侵襲的影響，為miR-19參與乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制理解，為miR-19作為乳腺癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑

人乳腺癌細(xì)胞株MCF7購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)。DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司。miR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000和MTT試劑盒購(gòu)自碧云天公司。Transwell侵襲小室購(gòu)自美國(guó)Costar 公司。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

設(shè)計(jì)miR-19基因擴(kuò)增引物，委托上海生物工程有限公司合成。上游引物P1：5’-GCAGTCCTCTGTTAGTTTTGC-3’，下游引物P2：5’-GCAGGCCACCATCAGTTTT-3’。按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。以細(xì)胞總RNA為模板，應(yīng)用miR反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)條件：94℃變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃，5 min。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞采用DMEM，37℃，5% CO2培養(yǎng)。將4×105～8×105/mL 的MCF7細(xì)胞接種于12孔板，加含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合度，按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。A組（空白組）轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體，B組（miR-19組）轉(zhuǎn)染pre-miR-19，C組（miR-19抑制組）轉(zhuǎn)染miR-19抑制物。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，向每孔加入含10%小牛血清的DMEM，于48 h收集細(xì)胞備用。利用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-19含量，使用U6B作為內(nèi)參基因，分析miR-19表達(dá)水平，計(jì)算公式為△Ct=Ct（miR-19）-Ct（U6B）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，胰酶消化后加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。死細(xì)胞被染成明顯藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率（%）= 死細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞活性和增殖試驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸收值，與活細(xì)胞數(shù)量呈正比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染48 h后的待測(cè)細(xì)胞胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×105/mL，將細(xì)胞加入到Transwell上室中，下室加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，取出小室內(nèi)薄膜，甲醇固定，Giemsa染色，移至載玻片上，干燥后樹脂封片，顯微鏡觀察，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在Transwell上室底部加入稀釋樹膠，37℃溫育其干燥，再加入待測(cè)細(xì)胞，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體、pre-miR-19和miR-19抑制物，48 h后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見表1。miR-19表達(dá)量結(jié)果顯示：B組細(xì)胞miR-19表達(dá)量高于A組，C組低于A組，提示MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR-19和miR-19抑制物后，細(xì)胞miR-19基因表達(dá)量分別上調(diào)和減少。細(xì)胞生長(zhǎng)情況結(jié)果顯示：B組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于A組（P < 0.05），C組高于A組（P < 0.05），提示miR-19 促進(jìn)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)；增殖活力結(jié)果顯示，B組細(xì)胞miR-19過表達(dá)促進(jìn)了MCF7細(xì)胞增殖（P < 0.05），C組細(xì)胞miR-19低表達(dá)抑制MCF7細(xì)胞增殖（P < 0.05），提示miR-19 促進(jìn)MCF7細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞遷移及侵襲能力檢測(cè)結(jié)果表明：B組細(xì)胞miR-19過表達(dá)促進(jìn)MCF7細(xì)胞遷移和侵襲（P < 0.05），提示miR-19能夠促進(jìn)MCF7細(xì)胞遷移和侵襲。

表1 三組細(xì)胞miR-19表達(dá)量、生長(zhǎng)情況、遷移及侵襲能力（x±s）

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤之一。乳腺癌發(fā)生發(fā)展與多種基因表達(dá)異常有關(guān)，主要包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。乳腺癌相關(guān)的原癌基因有CerbB2、Notch1等基因[3，4]，其表達(dá)產(chǎn)物具有促癌作用。此類原癌基因表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)乳腺癌復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移等生物事件。乳腺癌相關(guān)的抑癌基因有P27基因等，其表達(dá)產(chǎn)物具有抑癌作用。P27基因表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖活性增加，促進(jìn)乳腺癌發(fā)生及發(fā)展[5]。

miR基因的表達(dá)產(chǎn)物是一類內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼的小RNA分子，通過與目標(biāo)mRNA 配對(duì)，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與生物體發(fā)育、炎癥發(fā)生、腫瘤發(fā)生及進(jìn)展等生理、病理過程。miR基因的作用靶點(diǎn)可以是抑癌基因，也可為癌基因，既而發(fā)揮促癌或抑癌作用。近年研究證實(shí)，乳腺癌患者miR基因表達(dá)異常，其中miR-21、miR-155等基因表達(dá)上調(diào)[6，7]， Let-7、miR-145等基因表達(dá)下調(diào)[8，9]。

本文觀察到，MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pre-miR-19分子后，導(dǎo)致細(xì)胞miR-19基因過表達(dá)，引起MCF7細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，細(xì)胞遷移和侵襲能力也增強(qiáng)。反之，MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-19抑制物后，導(dǎo)致細(xì)胞miR-19基因低表達(dá)，造成MCF7細(xì)胞增殖活力減弱，但是細(xì)胞遷移和侵襲能力未受到明顯影響。本文認(rèn)為，可能與細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-19抑制物的劑量有關(guān)。本文研究結(jié)果提示，miR-19在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著正向調(diào)控作用，發(fā)揮原癌基因功能， miR-19分子能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲。

miR-19參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不十分明確，國(guó)外有學(xué)者報(bào)道，miR-19通過抑制PTEN來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。也有研究指出，miR-19可能通過上調(diào)NF-κB表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖[10]，在今后的工作中，miR-19在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有待深入研究。

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（收稿日期：2013-08-14）