光動力療法對人工口腔生物膜致齲變形鏈球菌抑制作用的研究

[摘要] 目的 探討光動力療法對口腔生物膜致齲變形鏈球菌抑制作用。 方法 選擇40顆新鮮健康恒牙標(biāo)本制備成釉質(zhì)塊，隨機分為4組每組10塊釉質(zhì)塊，依此置入人工唾液孵育形成人工獲得性膜，再置入變形鏈球菌液孵育人工致齲，單純HMME組，單純使用20 μg/mL HMME孵育；單純激光組，單純采用激光照射；光動力組，20 μg/mL HMME溶液孵育后進(jìn)行再激光照射；陰性對照組，采用生理鹽水處理。檢測菌斑生物膜變形鏈球菌菌落數(shù)及抗菌率、變形鏈球菌代謝產(chǎn)物、人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度評價各組抗菌作用及對釉質(zhì)質(zhì)量的影響。 結(jié)果 各組菌落數(shù)和抗菌率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組菌落數(shù)最少，抗菌率最高。各組終末pH值和△pH值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組終末pH值最高，△pH值最小。各組人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度最高。 結(jié)論 光動力療法對人工齲模型生物膜致齲變形鏈球菌抑制作用明顯，抑制變形鏈球菌產(chǎn)生代謝酸，保護(hù)牙釉質(zhì)提高抗齲能力，是一種有效的防齲方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 光動力療法；口腔生物膜；人工致齲；變形鏈球菌；光敏劑

[中圖分類號] R781.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）30-0021-03

齲病是最常見的口腔科疾病，口腔常在菌在多種因素作用下引起的感染性疾病，不僅影響口腔健康，與心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展都有密切聯(lián)系[1]?？谇簧锬な峭僖旱鞍孜窖烂嫘纬傻囊环N生物膜，牙菌斑是由于細(xì)菌感染在口腔生物膜內(nèi)滋生產(chǎn)酸而形成細(xì)菌性生物膜，溶解牙釉質(zhì)導(dǎo)致牙礦物質(zhì)流失，是齲病的直接原因。因此，抑制牙菌斑細(xì)菌活力和代謝是防治齲病的重要手段，光動力療法是利用可見光、近紅外或紫外光驅(qū)動，通過在生物組織中的光敏劑退激產(chǎn)生激發(fā)態(tài)單態(tài)氧導(dǎo)致多種生物分子氧化產(chǎn)生光動力，對于致病菌具有強烈的殺滅作用。血卟啉單甲醚（HMME）是第二代光敏劑，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、光敏劑化力強、光敏期短等優(yōu)勢，國外研究認(rèn)為應(yīng)用于光動力治療細(xì)菌性疾病效果較好[2]。本研究對光動力療法對人工口腔生物膜致齲變形鏈球菌抑制效果進(jìn)行評價，并對其機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年2～11月收集正畸減數(shù)治療拔除的年輕健康恒牙40顆，均排除齲、裂紋、菌斑。實驗菌株為中國科學(xué)院北京菌種保藏中心提供的變形鏈球菌（S.mutans，血清型C，ATCC25175）。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院提供，血卟啉單甲醚（HMME）購自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)學(xué)公司。紫外分光光度計（UV-2800A型，美國UNICO公司）、電熱培養(yǎng)箱（DNP9052型，杭州藍(lán)天化驗儀器廠）、低速離心機（ALLEGRA X-12型，美國BECKMAN）、顯微硬度計（432SVD型，美國Wilson公司）、半導(dǎo)體激光器（635 nm波長，美國IPS公司）。

1.3 方法

1.3.1 釉質(zhì)塊制備及人工獲得性膜形成[3] 將所收集新鮮恒牙標(biāo)本以PBS超聲清洗5 min，截根保留牙冠，縱劈為頰面釉質(zhì)塊，醫(yī)用酒精浸泡消毒，以頰面4 mm×4 mm區(qū)為開窗區(qū)，余部位采用丙烯酸樹脂包埋，僅暴露開窗區(qū)，再放入醫(yī)用酒精浸泡消毒24 h。根據(jù)文獻(xiàn)配方制備人工唾液，將完成消毒的釉質(zhì)塊放入，置于電熱培養(yǎng)箱37℃培育24 h，使釉質(zhì)表面形成人工獲得性膜。

1.3.2 細(xì)菌復(fù)蘇和培養(yǎng)及菌斑生物膜形成[4] 變形鏈球菌菌種在37℃厭氧復(fù)蘇48 h，置于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基繼續(xù)37℃厭氧培養(yǎng)24 h，涂片確定純培育則室溫下2 500 r/min離心15 min，提取細(xì)菌，調(diào)制菌液濃度為1×108 CFU/mL。將形成人工獲得性膜的釉質(zhì)塊置入由胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液和菌液按5∶1混合液中37℃厭氧孵育10 d，每48小時更換新配置混合液，形成人工齲。

1.3.3 分組抗菌處理 40塊釉質(zhì)塊隨機分成單純HMME組（1組）、單純激光組（2組）、光動力組（3組）和陰性對照組（4組）等4組各10塊。單純HMME組：置于20 μg/mL HMME溶液37℃厭氧孵育2 h；單純激光組：采用532 nm激光照射90 s，光斑直徑1 cm，功率密度0.14 W/cm2；光動力組：20 μg/mL HMME溶液37℃厭氧孵育2 h，再采用532 nm激光照射90 s，光斑直徑1 cm，功率密度0.14 W/cm2；陰性對照組：采用生理鹽水處理釉質(zhì)塊90 s。均于菌斑生物膜制備過程中更換培養(yǎng)液時進(jìn)行操作，各操作5次。

1.4 菌斑生物膜變形鏈球菌菌落數(shù)及抗菌率檢測[5]

采用平板細(xì)菌計數(shù)法檢測各組人工齲菌斑生物膜的變形鏈球菌計數(shù)，將各組釉質(zhì)塊加入2 mL生理鹽水，震蕩器震蕩混旋5 min，梯度稀釋至105 CFU/mL，取100 μL均勻涂布于胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)。活菌數(shù)（C）=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100，抗菌率（Rn）=（C4-Cn）/C4×100%（n=1，2，3）。

1.5 菌斑生物膜變形鏈球菌代謝產(chǎn)物檢測[6]

各組取出釉質(zhì)塊后，加入1 mL生理鹽水，震蕩器混旋5 min，3 000 r/min離心15 min，取上清，采用酸度計測定上清液中終末pH值，變化pH值（△pH）=7.0-終末pH值。

1.6 人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度測定

將釉質(zhì)塊固定于載玻片上，壓平，采用顯微硬度計，維氏壓頭施加0.49 N，10 s，測定開窗區(qū)3點硬度，間隔300 μm，取平均值作為釉質(zhì)塊表面顯微硬度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，計數(shù)資料采用率表示，采用χ2檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組抗菌作用比較

各組菌落數(shù)和抗菌率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組菌落數(shù)最少，抗菌率最高，其次為單純激光組，單純HMME組和陰性對照組差異并不顯著，見表1。

表1 各組菌斑生物膜變形鏈球菌菌落數(shù)及抗菌率比較

2.2 各組對菌斑生物膜變形鏈球菌代謝產(chǎn)物影響

各組終末pH值和△pH值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組終末pH值最高，△pH值最小，其次為單純激光組，單純HMME組和陰性對照組差異并不顯著，見表2。

表2 各組菌斑生物膜變形鏈球菌代謝酸pH值比較（x±s）

2.3 各組對釉質(zhì)塊表面質(zhì)量的影響

各組人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），光動力組人工齲釉質(zhì)塊表面顯微硬度最高，其次為單純激光組，單純HMME組和陰性對照組差異并不顯著，見表3。

3 討論

變形鏈球菌是主要的致齲口腔常在菌，屬革蘭陽性菌?？谇恢慢x菌多為革蘭陽性菌，革蘭陽性菌對光動力療法較革蘭陰性菌敏感[7]。本研究進(jìn)行口腔菌斑生物膜的制備，選擇新鮮健康恒牙作為釉質(zhì)塊標(biāo)本，配制人工唾液，避免全唾液收集可能存在的污染和病原體殘留，保證了人工生物膜的穩(wěn)定性和可靠性[8]；通過在人工唾液中37℃厭氧孵育創(chuàng)造人工口腔環(huán)境，使唾液蛋白和糖蛋白吸附與釉質(zhì)塊表面形成體外人工生物膜模型，浸泡菌液中使變形鏈球菌黏附和聚集于人工生物膜，持續(xù)滋生形成眾多菌落，形成菌斑生物膜模型，此法技術(shù)成熟，制備的菌斑生物膜模型成功率和穩(wěn)定性高[9]。菌斑生物膜一旦形成，其內(nèi)的變形鏈球菌便開始產(chǎn)生代謝酸，釉質(zhì)表面形成破壞，致齲菌的生物學(xué)活性增強，且抗酸休克、抗殺滅力較游離狀態(tài)提高。以往單純的抗菌藥物治療無法有效殺滅致齲菌，還極易產(chǎn)生耐藥性，治療效果不穩(wěn)定，還可能產(chǎn)生全身的不良反應(yīng)[10]。光動力療法是局部短時間的治療，不產(chǎn)生耐藥性，也不會產(chǎn)生全身反應(yīng)，具有一定的優(yōu)勢[11]。

本研究將制備成功的釉質(zhì)塊分別采用4種方式處理，并設(shè)計了陰性對照組，光動力療法是光敏劑與激光的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的抗菌作用，為考察光動力療法的效果，將光敏劑HMME和激光單獨使用，結(jié)果顯示，在陰性對照組4 mm×4 mm的釉質(zhì)表面菌斑生物膜中變形鏈球菌在10 d的培養(yǎng)期內(nèi)形成大量菌落，釉質(zhì)塊表面形成早期齲病狀態(tài)，單純HMME在菌斑生物膜培養(yǎng)過程中每48小時處理1次，并不能明顯減少菌落數(shù)，同樣存在著較明顯的齲病狀態(tài)，無明顯抗菌作用；單純低能量激光在10 d培養(yǎng)期每48小時照射1次，有一定的抑制菌群生長的作用，但效果并不顯著，而高能激光可能對牙釉質(zhì)及人體組織造成傷害，因此，單純低能量激光并不具有明顯的抗致齲菌的作用；光動力組將光敏劑和低能量激光結(jié)合，抗菌率高達(dá)99.64%，菌落計數(shù)顯著降低，僅為（0.61±0.02）CFU/mL，說明在激光與光敏劑的退激作用下釋放出單態(tài)氧是殺滅致齲菌的主要機制，強烈的氧化作用使變形鏈球菌等致齲菌結(jié)構(gòu)破壞、蛋白質(zhì)氧化，迅速失活及死亡，產(chǎn)生很強的光動力殺滅作用，是致齲菌無法形成有效的牙菌斑[12]。

致齲菌分解代謝食物中的糖，并在短時間內(nèi)代謝產(chǎn)生大量乳酸等有機酸，使菌斑生物膜pH值持續(xù)降低，當(dāng)?shù)陀?.0時對牙體產(chǎn)生腐蝕，使之脫礦，是其致齲的關(guān)鍵[13]。本研究通過對各組代謝物pH進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，陰性對照組終末pH值已較初始pH值（7.0）顯著降低，單純HMME組和單純激光組并未較陰性對照組有明顯的改善，而光動力組終末pH值則無顯著降低，△pH值最小，驗證了光動力療法對致齲菌的強烈抗菌作用使之無法產(chǎn)生大量的有機酸破壞牙體。齲病所致的脫礦，使牙釉質(zhì)表面硬度下降，降低了牙體對細(xì)菌感染和酸腐蝕的抵御能力，加速齲病的進(jìn)展[4]。對比各組釉質(zhì)塊表面顯微硬度顯示，陰性對照組表面顯微硬度最低，說明大量的菌落在菌斑生物膜中繁殖，產(chǎn)生大量有機酸，導(dǎo)致牙釉質(zhì)的腐蝕，硬度降低，而光動力組每48小時進(jìn)行一次干預(yù)，則可有效地抑制牙菌斑生成，避免釉質(zhì)表面硬度降低，防止齲病的發(fā)生和發(fā)展。

光動力療法通過低能量激光照射和光敏劑的作用釋放出具有強大生物殺滅活性的單態(tài)氧，對牙釉質(zhì)表面的致齲均有效殺滅，抑制菌斑生物膜形成，避免致齲菌代謝酸對牙釉質(zhì)的侵蝕，保護(hù)牙釉質(zhì)表面硬度。單態(tài)氧在光動力療法防齲作用中起極其重要的作用。

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（收稿日期：2013-07-08）