廣西火桐基因組DNA提取方法的研究

摘要：以廣西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]葉片為試料，比較了改良CTAB法、試劑盒法和改良SDS法提取基因組DNA的提取效果及對(duì)干燥葉和鮮葉提取的基因組DNA進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，改良CTAB 法和試劑盒法提取的基因組DNA質(zhì)量較好、雜質(zhì)少，適合廣西火桐基因組DNA的提取。改良SDS法提取的基因組DNA無(wú)完整條帶，質(zhì)量較差，不適合廣西火桐基因組DNA提取。硅膠干燥90 d的葉樣和新鮮葉樣所得的基因組DNA純度相當(dāng)，產(chǎn)率前者多于后者。

關(guān)鍵詞：廣西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]；基因組DNA；提取

中圖分類號(hào)：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-5060-03

Studies on Genomic DNA Extraction of Erythropsis kwangsiensis

LUO Wen-hua1，HUANG Shi-xun1，MA Hu-sheng1，F(xiàn)U Zhi-hong1，2，DAI Wen-juan1，

TANG Wen-xiu1，PAN Bo1，ZHAO Bo1

（1.Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chineses Academy of Sciences， Guilin 541006，Guangxi， China； 2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004，Guangxi， China）

Abstract： Using the leaves of Erythropsis kwangsiensis as material， the genomic total DNA was extracted. Three methods of genomic total DNA extraction including improved CTAB method， reagent box method and improved SDS method were compared. Results showed that the DNA extracted from improved CTAB method and reagent box method had high quality and less impurity， but quantity of the latter was less than that of the former. The reagent box method had the advantages of simple operation， short time and less harmful， but more expensive than that of the improved CTAB method. In addition， improved SDS method didn’t have the complete bands， so it was not suitable for genomic DNA extraction of Erythropsis kwangsiensis. The genomic DNA extracted from the leaves preserved in silica gel for 90 days were not significantly different from that of fresh leaves， and the yield of the former was much more than that of the latter.

Key words： Erythropsis kwangsiensis； genomic DNA； extraction

廣西火桐[Erythropsis kwangsiensis （Hsue） Hsue]隸屬梧桐科火桐屬（Erythropsis）植物，為中國(guó)特有種，僅分布于廣西壯族自治區(qū)中部至南部的石灰?guī)r地區(qū)，對(duì)研究植物區(qū)系和植物地理及親緣關(guān)系等均有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。其木材紋理直，材質(zhì)柔韌，不開(kāi)裂，是制作家具的上等用材；其先花后葉，花色鮮艷靚麗，花期長(zhǎng)，具有極高的經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值。由于人類的過(guò)度利用，廣西火桐野外種群和個(gè)體數(shù)量稀少，已處于瀕危狀態(tài)，為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[1]。目前，對(duì)廣西火桐的研究?jī)H限于光合速率、群落及種群生態(tài)學(xué)特征等方面[2-6]，其基因組DNA提取方法的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)研究了不同提取方法提取廣西火桐基因組DNA的提取效果，為廣西火桐的群體遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)，探討硅膠干燥葉樣與鮮葉DNA的區(qū)別，為野外樣品保存提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西火桐采自廣西壯族自治區(qū)靖西縣，選取無(wú)病蟲害的當(dāng)年生嫩葉，用變色硅膠室溫保存90 d，嫩葉完全干燥；廣西火桐新鮮嫩葉采自廣西植物研究所。

1.2 方法

1.2.1 不同提取方法提取基因組DNA 分別采用改良CTAB法[7]，植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）法和改良SDS法[7]提取總DNA。

1）改良CTAB法提取基因組DNA。①取0.1 g硅膠干燥葉片，加入適量石英砂，使用多樣品組織研磨機(jī)（美國(guó)BIOSPEC/Mini-BeadBeater-96）研磨成細(xì)粉。②加入2 μL β-巰基乙醇和800 μL預(yù)熱的2×CTAB抽提液。③充分混勻后于65 ℃水浴60 min，顛倒兩次混勻。④12 000 r/min離心10 min，抽提上清液至新EP管中，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1，V/V）充分混勻，12 000 r/min離心5 min，抽提上清液至新EP管中。⑤重復(fù)④一次。⑥上清液加1/10體積3 mol/L NaAC（pH 5.2），再加入等體積異丙醇，上下顛倒3～5次，至白色絮狀物出現(xiàn)，置-20 ℃冰箱沉淀過(guò)夜。⑦4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清。⑧沉淀物分別用70%無(wú)水乙醇洗滌兩次。⑨室溫下自然晾干，溶于20 μL的ddH2O中，保存于-20 ℃冰箱。

2）植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（上海捷瑞生物工程有限公司），操作步驟參照說(shuō)明書。

3）改良SDS法提取基因組DNA。將CTAB提取液換為SDS提取液[100 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，2%（W/V）SDS，pH 8.0]，其他操作步驟同CTAB法。

1.2.2 試劑盒法提取干燥葉和新鮮葉基因組DNA 分別稱取0.1 g硅膠干燥葉和1.0 g新鮮葉，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 基因組DNA檢測(cè)

1）取2 μL基因組DNA樣品以1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用生物電泳圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP）成像，觀察基因組DNA的大小、完整性及電泳條帶的清晰度。

2）用TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）檢測(cè)260 nm和280 nm下的吸光度。DNA純度決定于A260 nm/A280 nm的大小；DNA質(zhì)量濃度由DNA模板在260 nm的吸光度決定，A260 nm=1時(shí)，DNA質(zhì)量濃度為50 ng/μL[8]，DNA產(chǎn)率的大小按照下式計(jì)算：

DNA產(chǎn)率（μg/g）=

■

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取基因組DNA

從圖1中可知，改良CTAB法（C1、C2、C3）和試劑盒法（J1、J2、J3）提取得到的DNA有明顯的主帶，DNA完整，較明亮，質(zhì)量較高，無(wú)明顯的拖帶，兩種方法提取的DNA質(zhì)量相當(dāng)；改良SDS法（S1、S2、S3）無(wú)完整的DNA主帶，但有彌散的條帶，根據(jù)大小判斷DNA片段已降解為小分子。改良CTAB法和試劑盒法提取的基因組DNA最佳，適合提取廣西火桐基因組DNA；改良SDS法不適合廣西火桐基因組DNA的提取。3種方法提取得到的DNA的點(diǎn)樣孔亮度較低，說(shuō)明殘留物少，雜質(zhì)去除較徹底，提取得到的基因組DNA較純。

2.2 干燥葉和新鮮葉提取基因組DNA的比較

由圖2可知，鮮葉（X1，X2，X3）和干燥葉（G1，G2，G3）基因組DNA主帶明顯，譜帶清晰，完整性好。試劑盒法提取的硅膠干燥90 d的葉片基因組DNA和鮮葉的無(wú)明顯差異。有研究表明半年內(nèi)不同保存時(shí)期的材料對(duì)于基因組DNA提取幾乎沒(méi)有影響[9]，從變色硅膠干燥的葉片中提取的基因組DNA質(zhì)量與鮮葉無(wú)明顯差異， 且產(chǎn)率更高[10，11]。這可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)干燥，細(xì)胞內(nèi)含水量較少，部分酶活性降低，在提取過(guò)程中對(duì)DNA分離造成的干擾較小，更有利于DNA分離。因此，用變色硅膠快速干燥法保存材料是可行的。

2.3 產(chǎn)率及純度檢測(cè)

3 種方法提取的基因組DNA的純度及產(chǎn)率見(jiàn)表1。當(dāng)A260 nm/A280 nm約為1.8時(shí)，DNA較純；A260 nm/A280 nm大于1.8時(shí)，DNA中有RNA污染，A260 nm/A280 nm小于1.8時(shí)，DNA中有蛋白質(zhì)污染[12]。改良CTAB 法提取的基因組DNA的A260 nm/A280 nm在1.89～1.95 之間；試劑盒法提取的干燥葉基因組DNA的A260 nm/A280 nm在1.81～1.83之間，鮮葉的A260 nm/A280 nm在1.81～1.86之間；改良SDS法提取的基因組DNA的A260 nm/A280 nm 在1.12～1.32 之間。結(jié)果表明，改良CTAB法和試劑盒法提取的基因組DNA較純，鮮葉和硅膠干燥葉片基因組DNA的純度相當(dāng)，改良SDS法提取的基因組DNA中存在蛋白質(zhì)或酚雜質(zhì)。從產(chǎn)率上看，改良CTAB法為185～214 μg/g；試劑盒法提取干燥葉的基因組DNA為180～196 μg/g，略少于改良CTAB法；試劑盒法提取鮮葉的基因組DNA為156～172 μg/g，略少于干燥葉的基因組DNA；改良SDS法由于蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)污染無(wú)法精確計(jì)算產(chǎn)率。綜合上述結(jié)果表明，改良CTAB方法和試劑盒法提取的基因組DNA質(zhì)量明顯優(yōu)于改良SDS法，試劑盒法提取得到的鮮葉基因組DNA產(chǎn)率<干燥葉<改良CTAB法。

3 小結(jié)與討論

植物基因組DNA提取常用的是CTAB法，其具有穩(wěn)定性好、得率高、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，但其操作步驟繁瑣，所用藥品中的異丙醇、巰基乙醇等對(duì)人體毒性很大，且不同植物有不同的特性，采用傳統(tǒng)的CTAB法往往難以獲得滿意的結(jié)果。因此，研究者們針對(duì)不同的植物，創(chuàng)建了各種具有針對(duì)性的改良方法，使得改良后的CTAB法能夠提取到高質(zhì)量的基因組DNA[13，14]。植物基因組DNA提取試劑盒以CTAB法為基礎(chǔ)，采用獨(dú)特的相分離技術(shù)，結(jié)合DNA制備膜技術(shù)，有效地去除蛋白質(zhì)、多糖及脂質(zhì)等雜質(zhì)，得到高純度的基因組DNA，其特點(diǎn)步驟簡(jiǎn)潔、快速，提取到的DNA純度較高[15，16]。SDS法也被廣泛用于植物基因組DNA的提取，但該方法對(duì)于多糖含量高的植物提取效果不佳[17]。通過(guò)改良提取緩沖液的配方，能有效地回收材料中的基因組DNA，得到較為完整的基因組DNA[18]。

本研究中改良CTAB法和試劑盒法提取得到的基因組DNA有明顯的主帶，較完整，譜帶較亮，較為適合廣西火桐基因組DNA的提取。試劑盒提取基因組DNA耗時(shí)短，毒性小，純度更高，優(yōu)于改良CTAB法。但從產(chǎn)率上看，試劑盒提取基因組DNA略低于改良CTAB法。改良SDS法提取的基因組DNA條帶不完整，雜質(zhì)較多?？梢?jiàn)，SDS法只能針對(duì)某種特定材料作出改良，不具有對(duì)多種植物的普遍適用性。

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