基于trnH—PsbA序列的部分苔蘚植物親緣關(guān)系分析

摘要：以毛地錢（Dumortiera hirsuta）為外類群，利用ClustalX 2.0和MEGA 4.1軟件對(duì)13種苔蘚植物的trnH-PsbA基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析，構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。結(jié)果表明，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列長(zhǎng)度為174～186 bp，排序后總長(zhǎng)度為191 bp，其中變異位點(diǎn)51個(gè)，信息位點(diǎn)30個(gè)。遺傳距離在0.006～0.200，平均遺傳距離為0.103。利用非加權(quán)組平均數(shù)UPGMA（Unweight pair group method with arithmetic mean）法建立的系統(tǒng)樹(shù)顯示，13種苔蘚植物分為3組。在科間水平上，序列分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，trnH-PsbA序列對(duì)于苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：苔蘚；DNA條形碼；trnH-PsbA；親緣關(guān)系；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-5057-03

The Phylogenetic Relationship of Some Bryophytes Based on trnH-PsbA Gene

LIU Ying1，ZHANG An-shi1，ZHAO Li-xin2

（1. Department of Biology， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454003， Henan， China；

2. Jiaozuo National Foresty Plant of Henan Province， Jiaozuo 454191，Henan， China）

Abstract： Using Dumortiera hirsuta as the outgroup， trnH-PsbA genes belonging to 13 bryophyte species were analyzed and aligned to construct the phylogenetic trees using ClustalX 2.0 and MEGA 4.1 softwares. The results showed that the length of trnH-PsbA gene in 13 bryophytes were between 174 bp and 186 bp. The total length of sequence was 191 bp after alignment， including 51 variable sites and 30 informative sites. The genetic distance were between 0.006 and 0.200， with the average of 0.103. 13 species in the UPGMA tree（Unweight pair group method with arithmetic mean tree） were clustered into three groups. The constructed phylogenetic trees based on sequences were consistent with the results based on morphology among families. It is proved that trnH-PsbA sequence is useful for studying phylogenetics of bryophytes.

Key words： bryophyte； DNA barcoding； trnH-PsbA； phylogenetic relationship； phylogenetic development analysis

2003年，加拿大學(xué)者Hebert等[1]利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COI） 中的一段650 bp序列，發(fā)現(xiàn)該基因序列在動(dòng)物界不同分類水平上都具有良好的識(shí)別能力，從而提出了DNA條形碼（DNA barcoding）的概念，建立了一種新的物種鑒定技術(shù)[2]，為解決傳統(tǒng)分類學(xué)面臨的難題提供了新方法。由于線粒體COI基因在植物中的進(jìn)化速率遠(yuǎn)慢于動(dòng)物，因此，很多學(xué)者認(rèn)為植物的條形碼應(yīng)從進(jìn)化速率較快的葉綠體基因組中選擇[3，4]。

trnH-PsbA序列是進(jìn)化速率最快的葉綠體間隔區(qū)之一，兩端存在75 bp的保守序列，便于引物的設(shè)計(jì)。作為植物DNA條形碼的候選片段，trnH-PsbA序列具有引物通用性較好、擴(kuò)增成功率較高[5-8]等特點(diǎn)，并且平均長(zhǎng)度較短，有利于對(duì)降解材料的擴(kuò)增。本研究對(duì)13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列進(jìn)行測(cè)序并分析，從DNA水平上探討它們的親緣關(guān)系，為苔蘚植物系統(tǒng)發(fā)育研究、苔蘚植物的數(shù)字化鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料除毛地錢（Dumortiera hirsuta）（作為外類群，GenBank序列號(hào)：HQ026394.1）外，均采自河南省云臺(tái)山世界地質(zhì)公園（表1）。

1.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

采用改良CTAB法[9]提取苔蘚植物的基因組DNA。PCR引物為：PsbA-1f，5′- CTTGGCTCTTGCA

ACGATGA-3′； trnH-1r，5′-CCTCCCGCTTATTGATA

TGC-3′。PCR反應(yīng)體積為35 μL，包括3 ng/μL DNA 2.8 μL、10 μmol/L上、下游引物各2.1 μL、2×Taq Master Mix 17.5 μL；RNase-Free Water 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并送至金唯智生物科技（北京）有限公司純化后進(jìn)行單向測(cè)序。

1.3 序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

以毛地錢為外類群，將獲得的DNA序列用ClustalX 2.0軟件進(jìn)行比對(duì)。用MEGA 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。采用MP法和UPGMA法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)，以1 000次自舉分析（bootstrap）檢測(cè)各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 trnH-PsbA序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列長(zhǎng)度在174～186 bp，其中鱗葉蘚最長(zhǎng)，為186 bp，狹葉擬合睫蘚最短，為174 bp，其余均在176～181 bp。包括外類群毛地錢在內(nèi)的14種苔蘚植物的trnH-PsbA序列利用ClustalX 2.0對(duì)位排序時(shí)，將gap（空位）作missing（缺失）處理，排序后總長(zhǎng)度為190 bp，其中變異位點(diǎn)118個(gè)，信息位點(diǎn)37個(gè)。去掉外類群，排序后總長(zhǎng)度為191 bp，其中變異位點(diǎn)51個(gè)，信息位點(diǎn)30個(gè)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

用Kimura-2-Parameter距離模式計(jì)算的遺傳距離表明，13種苔蘚植物的遺傳距離在0.006～0.200，平均遺傳距離為0.103。其中多枝青蘚與小石蘚最大，為0.200，彎葉青蘚與絨葉青蘚最小，為0.006。最大簡(jiǎn)約樹(shù)的一致性指數(shù)CI為0.899 083，存留指數(shù)RI為0.838 235，存留一致性指數(shù)RCI為0.753 643。

利用UPGMA法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)表明（圖1），除外類群外，13種苔蘚植物形成兩個(gè)穩(wěn)定的分支。第一分支包含了7種叢蘚科苔蘚植物，其自展支持率為82%，第二分支包含了青蘚科和灰蘚科等6種苔蘚植物，其自展支持率為91%。其中青蘚科的絨葉青蘚、彎葉青蘚和多枝青蘚聚在一起，其自展支持率為98%；灰蘚科的金灰蘚、灰蘚凹葉變種和鱗葉蘚聚在一起，其自展支持率為62%，其分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。通過(guò)MP法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)（圖2）與UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)略有差異，MP樹(shù)顯示，灰蘚科的3種苔蘚植物沒(méi)能完全聚類在一起，但兩大分支結(jié)構(gòu)基本相同，因此，trnH-PsbA序列可用于苔蘚植物親緣關(guān)系的分析。

3 小結(jié)與討論

自從生物條形碼聯(lián)盟（CBOL）提出將trnH-PsbA序列作為植物DNA條形碼候選片段之后，trnH-PsbA已被廣泛地應(yīng)用于植物的系統(tǒng)發(fā)育研究中[10-13]。本研究利用trnH-PsbA序列對(duì)13種苔蘚植物的擴(kuò)增和測(cè)序的成功率均為100%，與有關(guān)研究有相似結(jié)果[14]。trnH-PsbA序列可以很好地支持13種苔蘚植物在科間水平上的親緣關(guān)系劃分。青蘚科和灰蘚科分別聚為一類，組成一支，叢蘚科組成另一支，完全符合形態(tài)學(xué)結(jié)果。但在叢蘚科苔蘚植物的科內(nèi)劃分上與形態(tài)學(xué)結(jié)果有一定差異，如親緣關(guān)系較近的小石蘚和狹葉擬合睫蘚，以及高山大叢蘚云南變種和闊葉叢本蘚并未聚在一起。不同的建樹(shù)方法可能得到不同的效果，Lahaye等[15]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，MP樹(shù)和UPGMA樹(shù)得到的物種正確識(shí)別率最高。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)更能說(shuō)明形態(tài)學(xué)結(jié)果。

由于不同序列的進(jìn)化速率不同，可能導(dǎo)致不同序列間的分析結(jié)果有所不同，因此，隨著植物DNA條形碼研究的深入，科學(xué)家提出以多片段組合在不同分類階元上并進(jìn)行綜合分析。Kress等[16]提出使用rbcL+matK+trnH-PsbA的片段組合構(gòu)建超級(jí)矩陣來(lái)解決不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。其中trnH-PsbA（即trnH-PsbA Ⅰ，trnH-PsbA Ⅱ，trnH-PsbA Ⅲ等）片段以目為單位進(jìn)行歸類。本研究結(jié)果顯示，13種苔蘚植物的trnH-PsbA序列分析結(jié)果在科間水平上與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，對(duì)于苔蘚植物的系統(tǒng)發(fā)育研究有一定的參考價(jià)值。

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