百合病毒的多重RT—PCR檢測技術(shù)

摘要：根據(jù)百合（Lilium brownii var. viridulum）常見的黃瓜花葉病毒（CMV）、百合斑駁病毒（LMoV）、無癥病毒（LSV）引物序列，設(shè)計(jì)2組特異引物，以18S rRNA為內(nèi)參基因，采用多重RT-PCR，2組引物均能擴(kuò)增得到LMoV和LSV預(yù)期大小一致的片段，未檢測到CMV，檢測結(jié)果不受病株取材部位的影響。該方法的建立為百合脫毒苗的規(guī)模化生產(chǎn)提供了高效檢測技術(shù)。

關(guān)鍵詞：百合（Lilium brownii var. viridulum）；病毒；多重RT-PCR

中圖分類號(hào)：S682.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-5051-03

Studies on Multiplex RT-PCR Detection on Viruses of Lily

ZOU Ying-chun1，2，YANG Chao-zhu2，QIN Da-ji1，2，ZHAO Qing-hua2，XIANG Ji-qian1，2，YIN Hong-qing1，2，

YANG Yong-kang1，2，HUANG Jian-min1，2，PI Lei1，2

（1. Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.， Ltd.， Enshi 445000， Hubei， China； 2. West Comprehensive Experiment Station of Hubei Provincial Agriculture ST Innovation Center， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： Based on the primers detecting lily （Lilium brownii var. viridulum） cucumber mosaic virus（CMV）， lily mottle virus（LMoV） and lily symptomless virus（LSV）， two groups of specific primers were designed. Using 18S ribosomal RNA as internal control gene， multiplex RT-PCR method were established to detect the 3 major viruses. LMoV and LSV were detected， but CMV was not detected. This detecting method will promote the large-scale production of the virus-free lily seedling.

Key words： lily（Lilium brownii var. viridulum）； virus； multiplex RT-PCR

百合（Lilium brownii var. viridulum）是百合科百合屬多年生草本球根植物，主要分布在亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區(qū)。我國栽培的百合種球主要依賴進(jìn)口，長期的無性繁殖導(dǎo)致優(yōu)良品種種球帶毒嚴(yán)重，部分病毒感染率高達(dá)60%[1]。目前，國內(nèi)外已報(bào)道侵染百合的病毒有20余種，其中黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）和百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）是目前危害最大的3種主要病毒，它們單獨(dú)和混合侵染可造成百合切花與鱗莖品質(zhì)和產(chǎn)量的嚴(yán)重下降[1-5]。對(duì)這3種病毒的檢測成為種球質(zhì)量評(píng)估的關(guān)鍵，也是后續(xù)的分球和組培生產(chǎn)脫毒苗關(guān)鍵技術(shù)[6-9]。

目前，常見的百合病毒檢測方法有電子顯微鏡法、血清學(xué)方法、分子雜交、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、血清學(xué)和PCR相結(jié)合的方法以及基因芯片法等。其中，RT-PCR方法被證實(shí)是目前特異性最強(qiáng)、靈敏度最高的病毒檢測方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病原診斷和檢測。而后來發(fā)展起來的多重RT-PCR（multiplex RT-PCR）可以一次檢測多種病毒，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成為百合等常年無性繁殖作物病毒的高效檢測方法。近年來湖北省恩施州百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展較快，引進(jìn)了不少國內(nèi)外品種，但病毒的檢測仍依賴于異地檢測。因此，本研究旨在建立百合病毒的多重RT-PCR檢測技術(shù)，為湖北省恩施州百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展和脫毒種球種苗生產(chǎn)以及疫病監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

百合病株樣本采集自湖北省恩施州雙河高山培育基地，均為從荷蘭引種的種球種植而成。病株采集參照徐秉良等[10]描述，主要表現(xiàn)為葉片黃斑，凹凸，扭曲，褐化，深綠色斑點(diǎn)，花的癥狀為褐色斑點(diǎn)，植株癥狀為矮化。

1.2 試劑

植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖溶液、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、10×Taq Reaction Buffer、Taq DNA Polymerase 均購自Promega公司，dNTPs、10×Loading Buffer、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 多重RT-PCR 檢測方法確立

用植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取百合葉片和鱗莖總RNA，具體方法依照說明進(jìn)行。第一組引物和第二組引物分別參照王沖等[1]和徐榕雪等[11]設(shè)計(jì)而成（表1）。RT-PCR 40 μL反應(yīng)體系為：總RNA 8 μL，Oligo-d（t）1 μmol/L，72 ℃變性5 min，立即取出置于冰上放置5 min。再依次加入：5×M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8 μL，dNTPs 4 mmol/L，M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶40 U，加入DEPC處理過的ddH2O 14 μL。將反應(yīng)混合物于PCR儀中42 ℃延伸1 h，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎?5 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，包括：cDNA，上、下游引物，dNTPs，10×Buffer（含MgCl2），Taq 酶1.25 U，ddH2O補(bǔ)足至25 μL 。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[5]。以1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）在標(biāo)準(zhǔn)紫外光下成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合不同組織部位總RNA的提取

植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]分別選取百合葉片和鱗片總RNA， RNA質(zhì)量較好，完全滿足病毒檢測（圖1）。

2.2 多重RT-PCR檢測百合不同組織部位病毒

應(yīng)用第一組引物，進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，獲得片段大小分別為240、305 bp，內(nèi)參基因?yàn)?97 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。用第二組引物，對(duì)葉片和鱗片組織進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，獲得片段大小分別為171、428 bp，健康葉片只能擴(kuò)增出197 bp的內(nèi)參基因條帶，未擴(kuò)增出非特異性條帶（圖3）。病毒在植株內(nèi)部分布均勻，檢測結(jié)果不受取材部位的影響，可在不同的繁殖時(shí)期和生育階段檢測。2組引物特異性均較好，可任選其一。在取樣的病株中，部分植株存在 LMoV和LSV單獨(dú)或混合感染，未檢測到CMV感染，可能與病毒的發(fā)生普遍率及取材有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

目前，在侵染百合的病毒中，LMoV、LSV和CMV是報(bào)道最多的3種侵染百合的病毒，侵染幾率高，分布廣，且常常表現(xiàn)出2種或3種病毒的混合侵染。因此，建立多重RT-PCR檢測方法十分重要。本研究所用2組檢測引物，擴(kuò)增特異性均非常好，能夠良好的分辨出兩種病毒和內(nèi)參基因。第一組引物中所用內(nèi)參基因的擴(kuò)增效果很好，能有效消除假陽性。在RNA提取過程中，百合的鱗莖組織致密，在液氮中變得十分堅(jiān)硬，研磨困難，研磨前需充分破碎，這樣的操作可能會(huì)對(duì)百合RNA的質(zhì)量產(chǎn)生影響，但并未影響最終的檢測結(jié)果，證明此方法可行。此外葉片擴(kuò)增效率大于鱗莖可能受鱗莖研磨不夠充分或病毒在鱗莖中分布不均勻所致。因此，為提高檢測可靠性，可以加大鱗莖的研磨量并充分研磨。

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