加工工藝對石榴葉茶酚類物質及抗氧化活性的影響

摘要：為比較不同加工工藝對石榴葉茶酚類物質及抗氧化活性的影響，采用葉齡約1個月充分展開的石榴鮮葉，殺青烘干作為對照，按照傳統(tǒng)的加工工藝分別制成綠茶和紅茶，采用分光光度法和HPLC法分析了茶樣中的多酚類物質，通過測定茶樣對DPPH·自由基的清除能力來評價其抗氧化活性。結果表明，與干葉相比，綠茶中總酚及兒茶素含量基本保持不變，紅茶中總酚和兒茶素分別下降了30.8%和60.3%，抗氧化活性表現(xiàn)明顯下降；紅茶中茶紅素和茶黃素分別增加了194.3%和181.4%，而綠茶中茶紅素和茶黃素稍有增加；綠茶和紅茶中鞣花酸分別減少了6.3%和9.3%。因此，加工成綠茶可保持較高的多酚含量和抗氧化活性，加工成紅茶則可改善茶的感官品質。

關鍵詞：加工工藝；石榴葉茶；鞣花酸；兒茶素

中圖分類號：Q946.84+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5037-04

Effects of Processing Techniques on the Phenolic Constituents and Antioxidant Activity of Pomegranate Leaf Tea

ZHANG Li-hua1，2，WANG Yu-hai2，ZHAO Gui-mei3，ZHANG Yuan-hu1

（1. State Key Laboratory of Crop Biology/Life Science College， Shandong Agricultural University， Taian 271018，Shandong，China；

2. Life Science College， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160，Shandong，China；

3. Zaozhuang Vocational College， Zaozhuang 277800，Shandong，China）

Abstract： The objective of this study was to investigate the effects of processing techniques on the phenolic constituents and antioxidant activity of pomegranate leaf tea. The fresh leaves after sprouting 1 month were oven-dried at 80 ℃， made respectively into green tea and red tea with traditional techniques. The results showed that contents of total phenolics and catechins in greea tea were kept unchanged comparing with dried leaves. But those in red tea decreased 30.8% and 60.3%， respectively. The antioxidant activity of red tea decreased obviously. The contents of thearubigin and theaflavin in red tea increased 194.3% and 181.4%， but there was significantly increase in green tea. In addition， the contents of ellagic acid decreased both in green tea （6.3%） and in red tea（9.3%）. Therefore， green tea made from pomegranate leaves had significantly higher contents of total phenolics and antioxidant activity. The sensory quality of red tea was improved.

Key words： processing techniques； pomegranate leaf tea； ellagic acid； catechins

石榴（Punica granatum L.）葉中含有豐富的生物活性物質，包括多酚、黃酮及三萜類等，尤以多酚含量最高，可達干重的10%～20%，包括兒茶素類、鞣花酸、沒食子酸等[1-3]。研究表明石榴多酚具有多種生物活性，能與自由基發(fā)生反應，表現(xiàn)較強的抗氧化能力[4]，另外，還具有抗菌、抗腫瘤、降血脂以及防治心腦血管疾病等活性[5，6]。近年來， 在亞洲和歐美等國家， 掀起了開發(fā)利用石榴葉的熱潮， 并研發(fā)出多種產品， 石榴茶是其中的典型代表。石榴茶是以石榴樹的嫩梢或樹葉為原料， 按照茶葉加工工藝制成的茶類固體飲料。目前， 國內外關于石榴葉生物活性方面的研究較多， 而對加工工藝方面的研究較少， 對不同工藝加工的石榴葉茶酚類物質及抗氧化活性的比較研究未見報道。本試驗按照綠茶和紅茶加工工藝， 將同一批石榴葉分別制成綠茶和紅茶， 通過分析感官品質、化學成分及抗氧化活性， 研究不同加工工藝對石榴茶品質的影響， 為科學開發(fā)石榴葉資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮葉于2009年5月15日在棗莊石榴園采摘，品種為大青皮石榴。采摘標準為葉齡約1個月充分展開的葉片。

1.2 儀器與試劑

DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；UV-2550 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；數(shù)顯HH-4恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；高效液相系統(tǒng)（Waters600泵2487雙波長紫外檢測器，美國Waters公司）。

兒茶素標準品為Sigma公司產品，鞣花酸標準品由清華大學邢東明教授惠贈，液相色譜用甲醇為色譜純，去離子水，其他試劑為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 石榴葉茶加工 將部分石榴鮮葉用鼓風干燥箱在105 ℃下殺青處理15 min，然后在65 ℃下充分干燥作為對照；其余鮮葉分別按綠茶、紅茶的加工工藝制成綠茶和紅茶，其中綠茶工序為：鮮葉→攤放→殺青→做形→炭火炒鍋炒制干燥；紅茶工序為：鮮葉→萎凋→揉捻→發(fā)酵→快烘→復揉→炭火烘籠干燥。

1.3.2 多酚溶液的提取 干葉、綠茶和紅茶經研磨成粉，并過40目篩。取0.2 g粉狀樣品置于錐形瓶中，加入50%（V/V）甲醇溶液20 mL，65 ℃水浴浸提2 h，過濾后的濾渣再浸提1次，合并濾液后定容至50 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾后用于HPLC分析鞣花酸和兒茶素含量。

1.3.3 茶樣的感官審評 由茶葉審評專家對綠茶和紅茶的外形、湯色、香氣、滋味、葉底進行審評。

1.3.4 含水量測定 采用105 ℃烘干稱重法測定，其計算公式為：含水量=（初始質量-充分干燥后質量）/初始質量×100%。

1.3.5 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法測定樣品的總酚含量，以沒食子酸（GA）為標準品。

1.3.6 鞣花酸、兒茶素含量測定 采用高效液相色譜外標法[7-9]定量分析。其色譜柱為Symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，B相為0.2%磷酸，梯度洗脫，0～10 min：A相10%→30%（V/V，下同）、B相90%→70%，10～40 min：A相30%→100%、B相70%→0%；洗脫液流速1 mL/min，檢測溫度為30 ℃，進樣量20 μL，鞣花酸和兒茶素的檢測波長分別為254 nm、210 nm。

1.3.7 標準品的制備 精確稱取鞣花酸標準品15.92 mg，用二甲亞砜溶解并定容至50 mL，制成0.318 4 mg/mL溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，作為鞣花酸標準品溶液；精確稱取兒茶素標準品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL， 濃度為10 μg/mL，過0.45 μm的微孔濾膜，作為兒茶素標準品溶液。

1.3.8 茶黃素和茶紅素含量測定 采用Roberts法[10]。稱取茶樣9 g，置于500 mL錐形瓶中，加沸水375 mL，于沸水浴10 min，用脫脂棉過濾，冷卻。吸取濾液50 mL，注于分液漏斗中，加乙酸乙酯50 mL，振搖（避免形成乳濁液）。吸取乙酸乙酯層25 mL，注于分液漏斗中，加25%（m/V）的碳酸氫鈉溶液25 mL，強烈振蕩30 s，靜置分層，棄去水層，立即吸取乙酸乙酯層4 mL，加甲醇定容至25 mL（溶液A）。吸取水層2 mL，加水稀釋至10 mL，再加甲醇定容至25 mL （溶液B）。另取水層2 mL，加飽和草酸溶液2 mL和水6 mL，再加甲醇定容至25 mL（溶液D）。吸取isobutyl methyl ketone層25 mL，注入分液漏斗中，加入25%碳酸氫鈉溶液25 mL，強烈振蕩30 s，靜置分層，棄去水層，立即吸取乙酸乙酯層4 mL，加甲醇定容至25 mL（溶液C）。于波長380 nm處測定溶液A、B、C、D的吸光度EA、EB、EC、ED。計算茶黃素和茶紅素的含量。

茶黃素含量=EA×2.25×100%

茶紅素含量=（2EA+2ED-EC-2EB）×7.06×100%

1.3.9 清除DPPH·自由基能力測定 參照文獻[11]中的方法：向3 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH·甲醇溶液中加入一定量的試樣（空白對照用等量去離子水代替），總體積用去離子水補充至4 mL，用力搖勻，室溫靜置30 min后，測定DPPH·混合溶液在517 nm處吸光值（A），用2.5 mL甲醇與0.5 mL試樣混合液調儀器零點，以扣除本底對照。自由基清除率=（A0-A樣）·A0-1×100%。每種試樣加入一定量，作曲線方程，求出達到50%清除率時所需樣品的濃度（即IC50），用IC50來比較各個樣品對DPPH·自由基清除能力大小。

2 結果與分析

2.1 茶樣的感官審評結果

綠茶和紅茶樣的感官評審結果如表1所示。從表1中可知，不同工藝對石榴茶感官指標的影響明顯，石榴葉綠茶綠湯綠葉；石榴葉紅茶紅湯紅葉，香氣高甜，滋味甜醇等。

2.2 茶樣含水量

干葉、綠茶和紅茶的含水量結果如表2所示。其中干葉、綠茶、紅茶的含水量分別為4.5%、5.3%、4.6%，綠茶和紅茶的含水量均符合干茶含水量小于6%的標準。

2.3 茶樣中總酚、鞣花酸及兒茶素含量

干葉、綠茶、紅茶中的總酚含量（占干重含量）測定結果如表2所示，干葉、綠茶、紅茶的總酚含量分別為115.05、114.29、79.58 mg/g。若以干葉中的總酚含量為100%，綠茶中總酚含量與干葉相比幾乎沒有變化，而紅茶下降了30.8%。

采用RP-HPLC法分析（檢測波長254 nm、210 nm）干葉、綠茶和紅茶中的鞣花酸、兒茶素含量，外標法定量，其中標樣圖譜見圖1-A和圖2-A，干葉圖譜見圖1-B和圖2-B，綠茶和紅茶的RP-HPLC圖譜與干葉的類似，圖略。鞣花酸、兒茶素的含量測定結果見表2，其結果表明，干葉、綠茶、紅茶中鞣花酸含量分別為2.36、2.21、2.14 mg/g，相對于干葉而言，綠茶和紅茶中的鞣花酸含量變化均較小，僅減少6.4%和9.3%；干葉、綠茶、紅茶中兒茶素含量分別為7.16、6.69、2.84 mg/g，相對于干葉而言，綠茶中兒茶素含量下降了6.6%，而紅茶中兒茶素含量下降了60.3%。

2.4 茶樣中茶紅素和茶黃素含量

干葉、綠茶和紅茶中的茶紅素含量測定結果見表2。與干葉中茶紅素相比，綠茶僅上升了5.2%，而紅茶則增加了194.3%。說明在紅茶加工過程中，茶紅素含量顯著上升。

茶黃素在干葉、綠茶、紅茶中的含量測定結果見表2。相對于干葉而言，綠茶中茶黃素含量提高約9.3%，而紅茶中茶黃素含量增加了181.4%。

2.5 抗氧化活性

對DPPH·自由基的清除能力常被用于表示物質抗氧化能力的大小[12，13]，通常以DPPH·自由基的半抑制濃度（IC50）表示（IC50與抗氧化能力成反比例關系）。樣品的IC50結果見圖3，綠茶（56.77 μg/mL）與干葉（56.32 μg/mL）的抗氧化能力基本一致，紅茶（79.34 μg/mL）的抗氧化能力明顯低于干葉和綠茶（P<0.01）。3種樣品的IC50均高于陽性對照維生素C（14.94 μg/mL），但由于IC50是以干樣計算，表明樣品的抗氧化能力較高。

3 討論

本文采用了分光光度計法和RP-HPLC法系統(tǒng)地研究了石榴葉中的主要多酚類物質在綠茶、紅茶加工中的變化。比較幾種酚類物質的含量，與干葉相比綠茶中多酚總量幾乎沒有變化，而紅茶多酚總量下降了30.8%；綠茶中兒茶素含量變化也較小，而紅茶中兒茶素含量卻下降了60.3%；綠茶中茶紅素和茶黃素稍有增加，而紅茶中茶紅素和茶黃素增加明顯。這主要是由于綠茶為非發(fā)酵茶，在加工中首先采用高溫殺青迅速使多酚氧化酶和過氧化酶等酶系失活，有效地抑制了多酚類物質的氧化，綠茶中多酚總量與干葉中多酚總量幾乎一致。紅茶為全發(fā)酵茶，紅茶發(fā)酵的化學本質是由于多酚類物質特別是兒茶素類在多酚氧化酶的作用下發(fā)生氧化反應，生成茶黃素、茶紅素和茶褐素等物質，同時在兒茶素類的氧化過程中發(fā)生了一系列的偶聯(lián)氧化反應，從而形成紅茶特有的色、香、味等品質特征[14]。由于發(fā)生的氧化作用劇烈，盡管兒茶素的氧化產物茶黃素、部分茶紅素、部分茶褐素為可溶性多酚類物質，但有相當一部分的茶紅素和茶褐素以及兒茶素氧化過程中的中間產物鄰醌類物質會與蛋白質結合形成不溶于水的化合物沉著于葉底，外觀上表現(xiàn)出葉底為紅褐色，從數(shù)量上則表現(xiàn)為茶湯中的多酚顯著下降。本試驗結果表明，紅茶中的多酚總量與干葉相比，下降幅度為30.8%，而有文獻報道普通紅茶水溶性多酚下降幅度達43.8%[14]，可能是因為不同種類植物的多酚組成存在差別，石榴葉中兒茶素類在多酚總量中所占比例較低。

紅茶中兒茶素含量下降明顯，而鞣花酸變化不大，表明在紅茶發(fā)酵過程中酚類物質各種成分并非均一地被氧化，可能兒茶素類更容易被氧化。茶樣中的茶黃素和茶紅素含量的Roberts法測定結果表明，干葉和綠茶中存在一定量的茶黃素和茶紅素，可能是由于鮮葉在殺青之前的采摘、運輸及攤放過程中鮮葉的兒茶素在多酚氧化酶和過氧化物酶的作用下，發(fā)生一定程度的氧化形成了茶黃素和茶紅素。研究表明多酚是石榴葉中發(fā)揮抗氧化作用的主要成分[4，5]，本試驗結果顯示綠茶清除自由基的能力與干葉基本一致，而紅茶清除自由基的能力卻明顯下降，抗氧化能力與其總酚含量表現(xiàn)出正相關性，也再一次印證了這一觀點。

4 小結

結果表明， 不同加工工藝對石榴葉茶的感官品質和化學成分影響顯著。按本試驗的加工方法制成的石榴葉綠茶和紅茶基本能夠達到綠茶和紅茶的品質要求， 沒有產生特異氣味，口感較好。比較而言，不經發(fā)酵的石榴葉綠茶的總酚含量和抗氧化活性較高；而發(fā)酵工藝可以較好地改善石榴茶的香氣品質， 所制石榴葉紅茶表現(xiàn)出甜香特征，2種茶葉各具特色，能適應不同消費者的需求，而對石榴葉紅茶的香氣成分及形成機理需作進一步研究。

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