玫瑰多糖的酶法提取及柱前衍生HPLC分析

摘要：通過酶法提取玫瑰多糖，用柱前衍生高效液相色譜法分析含量。結(jié)果表明，非酶法對干花和玫瑰花渣的多糖提取率分別為9.865、5.087 g/100 g；酶法對其的多糖提取率為12.487、7.599 g/100 g。用柱前衍生高效液相色譜法分析玫瑰多糖，發(fā)現(xiàn)該多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6種單糖組成的，其物質(zhì)量比為0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5。酶法提取和不加酶提取的玫瑰多糖一級結(jié)構(gòu)的糖組成相同。

關(guān)鍵詞：玫瑰多糖；酶法提?。恢把苌?；一級結(jié)構(gòu)

中圖分類號：O657.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5031-03

Analysis of Rose Polysaccharide by Enzyme Extraction and Pre-column

Derivatization HPLC

ZHANG Yue-hui1，HAN Li-wen2，ZHENG Lan2，SHI Jian-guo2，YANG Jun-hui2，MA Yao-hong1

（1.Shandong Institute of Light Industry， Jinan 250353， China； 2. Biology Institute / Key Laboratory for Biosensor of Shandong Province，Shandong Academy of Sciences， Jinan 250014， China）

Abstract： Polysaccharide of rose was extracted by enzyme method and analyzed by HPLC with pre-column derivatization. The results showed that the yield rate of rose polysaccharide from dried flowers and rose dregs by normal method were 9.865 g/100 g， 5.087 g/100 g， respectively. The yield rate of rose polysaccharide by enzyme method were 12.487 g/100 g， 7.599 g/100 g， respectively. The results of monosaccharide composition of rose polysaccharide by HPLC with pre-column derivatization showed that it was composed of mannose， rhamnose， glucuronic acid， glucose， galactose and arabinose with a molar ratio of 0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5. The sugar composition of primary structure of rose polysaccharide extracted by enzyme method was the same as those extracted by normal method .

Key words： rose polysaccharide； enzyme method extraction； pre-column derivatization； primary structure

多糖作為一種生命活性物質(zhì)，具有清除自由基和抗腫瘤作用[1，2]?？仔奈嫉萚3]通過腫瘤壞死因子（TNF）單克隆抗體的ELISA法，發(fā)現(xiàn)野玫瑰多糖通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的分泌而對急性腎炎有一定的治療作用。白偉芳[4]測定了玫瑰花多糖在體外對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用，以及玫瑰花多糖的抗腫瘤活性。玫瑰花中的總糖質(zhì)量濃度高達29.5 g/100 g，其中可溶性糖8.8 g/100 g。馬猛華等[5]提取玫瑰花中多糖，提取率為0.6 g/100 g。陳曉梅等[6]分析了鐵皮石斛原球莖多糖的結(jié)構(gòu)和功能。本試驗分析了玫瑰花提取精油后廢水廢渣中多糖的提取方法，并以1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮（PMP）作為柱前衍生劑[7，8]，采用HPLC分析其單糖及糖醛酸的組成，并鑒定酶法對單糖及糖醛酸的組成有無影響，以期為多糖結(jié)構(gòu)及功能研究和玫瑰花的綜合開發(fā)利用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰干花以及經(jīng)提取玫瑰精油的干玫瑰花渣由濟南惠農(nóng)玫瑰花精油有限公司提供；纖維素酶（山東食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，食品級4萬酶活）；果膠酶（山東食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，食品級3萬酶活）；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖均購自美國Sigma公司。

色譜純乙腈；1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮（衍生化試劑PMP）、濃硫酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、次甲基藍、亞鐵氰化鉀等均為分析純；去離子水。

1.2 儀器

SGD-Ⅳ還原糖測定儀（山東省科學院生物研究所）；HH-S恒溫水浴鍋（江蘇國勝實驗儀器廠）；電子萬用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；FA1004N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；101A-2電熱鼓風干燥箱（南通宏大實驗儀器有限公司）；L-2000型高效液相色譜儀（日立公司）；Alltech Apollo C18色譜柱（美國奧泰公司）；20PR-52D冷凍高速離心機（日立公司）；TGL-16G飛鴿牌離心機（上海安亭科學儀器廠）；XW-80A漩渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰花多糖酶法提取方法 稱取36 g玫瑰干花2份，標記為A、B；稱取玫瑰花渣2份，標記為C、D。用纖維素酶處理A、C，條件為：50 ℃，pH 4.6，150 min，酶加量為4.5 g/100 g[9]，加液量為8∶1；然后再用果膠酶[10，11]處理A、C，條件為：45 ℃，pH 3.5，120 min，酶加量為0.1 g/100 g。B、D分別在50 ℃水浴150 min、45 ℃水浴120 min。最后，將A、B、C、D補水至料水比為1∶30[5]，100 ℃提取5 h，并以3 500 r/min離心15 min，取上清液加熱濃縮至100 mL，待溫度降至60 ℃后倒入5倍體積60 ℃、95%（V/V）的乙醇中，封口靜置12 h。取下層沉淀離心，沉淀轉(zhuǎn)移至平板中，用去離子水沖洗以確保多糖完全轉(zhuǎn)移至表面皿，并置于60 ℃烘箱中烘干，稱重。

1.3.2 多糖水解 分別稱取上述玫瑰多糖樣品0.5 g，置于具塞試管內(nèi)，加入10 mL 1 mol/L的H2SO4于沸水浴中水解8 h，同時設(shè)置一組空白對照，以去離子水代替H2SO4。水解后，將水解液和空白對照于10 000 r/min離心10 min，取上清液4.5 mL用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7，并定容至10 mL，以10 000 r/min離心10 min，取上清液待衍生化[12-15]。

1.3.3 柱前衍生 稱取4.355 g PMP溶于50 mL甲醇中，配制0.5 mol/L PMP溶液；稱取6.978 g醋酸銨和0.9 mL乙酸，以去離子水定容至1 L，配制pH 5.5的醋酸銨溶液。準確配制2 mmoL/L的甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等8種單糖標準品單品溶液及混合溶液。取該溶液50 μL，加入50 μL 0.5 moL/L的PMP甲醇溶液及50 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液，渦旋30 s，70 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，再加入50 μL 0.3 mol/L的HCl、100 μL去離子水稀釋混勻后，加入900 μL氯仿渦旋混勻30 s，靜置5 min，棄去下層液，再重復(fù)加入氯仿萃取2 次，上層液即為標準品衍生液。取50 μL待測樣品按照上述衍生方法處理，得衍生化樣品。每個樣品設(shè)3個平行，過0.45 μm微孔濾膜后合并，待HPLC分析[12-15]。

1.3.4 色譜條件 Alltech Apollo C18色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為醋酸銨緩沖液（pH 5.5）-乙腈（77∶2，V/V），流速1 mL/min，檢測波長245 nm，進樣量20 μL。醋酸銨緩沖劑與乙腈使用前分別用水膜與有機溶劑膜進行抽濾，過濾后超聲20 min去氣泡。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花多糖的提取

玫瑰干花和玫瑰花渣經(jīng)2種酶依次提取與非酶法提取的多糖含量與提取率結(jié)果見表1。酶法提取優(yōu)于非酶法，其中玫瑰干花中多糖提取率多2.6 g/100 g，玫瑰花渣中多2.5 g/100 g，可能是由于纖維素酶與果膠酶水解細胞壁，促進細胞中多糖的釋放。加酶和不加酶的玫瑰干花中多糖提取量高于玫瑰花渣，可能是由于36 g玫瑰干花是干重，玫瑰花渣是濕重，另外玫瑰花渣是玫瑰花提取精油后的殘留物，在提取精油的過程中會有部分損失。

2.2 柱前衍生高效液相色譜分析結(jié)果

2.2.1 對照品高效液相色譜圖 混合標準品色譜圖見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留時間依次為12.0、16.5、17.5、20.0、21.0、28.5、31.0、34.5 min。

2.2.2 玫瑰粗多糖的高效液相色譜分析 采用“1.3.4”條件分析玫瑰多糖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，玫瑰多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6種單糖組成的，色譜峰峰高見表2。通過外標法計算得出甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5。其中酶法與非酶法提取的多糖中單糖組成及含量見表3，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量幾乎相同。結(jié)果表明，加酶和沒加酶提取的玫瑰多糖組成成分相同。

3 結(jié)論

用酶法提取玫瑰干花、玫瑰花渣的多糖提取率分別為12.487、7.599 g/100 g，普通方法與酶法提取多糖的單糖及糖醛酸組成相同。用柱前衍生高效液相色譜分析了玫瑰多糖的單糖和糖醛酸組成與摩爾比，即甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為0.934 4∶ 0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5，該結(jié)果為開發(fā)利用提取玫瑰精油后的殘渣資源提供了參考。

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