米糠多糖脫蛋白方法及條件的優(yōu)化

摘要：木瓜蛋白酶結(jié)合三氯乙酸（TCA）法對米糠粗多糖進行脫蛋白，研究不同的酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酶解時間、TCA用量、TCA處理次數(shù)、TCA處理時間對米糠粗多糖脫除蛋白效果和多糖損失的影響。結(jié)果表明，米糠粗多糖脫蛋白最佳工藝條件為酶添加量140 U/mL，酶解最適溫度55 ℃，最適pH 6.0，時間60 min；再用6% TCA作用30 min，3次重復，蛋白質(zhì)脫除率為85.52%，多糖損失率為11.20%。

關(guān)鍵詞：米糠多糖；脫蛋白；三氯乙酸（TCA）法；蛋白質(zhì)脫除率；多糖損失率

中圖分類號：TS210.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5014-04

Removing Protein and Optimizing Condition from Rice Bran Polysaccharide

XUN Yun1，ZHANG Ying-qing2

（1.Biological Engineering Institute，Wuhan Institue of Technology， Wuhan 430072，China；

2.Bioengineering College， Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract： The technology of protein removing from rice bran polysaccharide was studied by the combination of papain and trichloroacetic acid（TCA）.The results showed that the best technological conditions were as the follows enzyme dosage 140 U/mL，hydrolysis temperature 55 ℃， pH 6.0， 60 min. Then the polysaccharides were treated with 6% TCA three times for 30 min， the rate of protein-removing was 85.52% and the rate of polysaccharide-losing was 11.20%.

Key words： rice bran polysaccharide； protein removing； trichloroacetic acid（TCA） method； the rate of protein-removing； the rate of polysaccharide-losing

多糖是與人類生活緊密相關(guān)的一類生物高分子物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降血脂、抗凝血等多種生物活性。米糠是稻谷加工過程中的農(nóng)副產(chǎn)物，通常米糠含油脂14%～24%、蛋白質(zhì)12%～18%、無氮浸出物33%～35%、水分7%～14%、灰分8%～12%，此外還含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷維素、二十八碳烷醇、？琢-硫辛酸、角鯊烯、神經(jīng)酰胺等多種天然抗氧化劑和生理功能卓越的生物活性物質(zhì)。米糠中無氮浸出物主要為淀粉、纖維素和半纖維素，一部分半纖維素構(gòu)成了水溶性米糠多糖（Rice bran polysaccharide，RBS），它是一種結(jié)構(gòu)復雜的雜聚糖，由木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等組成[1-4]。

米糠多糖的提取方法有多種，包括傳統(tǒng)熱水浸提法、超聲波輔助提取法、高壓脈沖輔助提取法、微波輔助提取法等[5]。這些方法提取得到的米糠粗多糖都含有一定量的蛋白質(zhì)。這些雜蛋白影響了米糠多糖的結(jié)構(gòu)和功效。故脫除米糠粗多糖中的雜蛋白并保留米糠多糖十分重要[6]。

傳統(tǒng)Sevag法和三氯乙酸（TCA）法去除蛋白質(zhì)通常需要重復10次，費時，樣品損失很大，而且需要處理廢液[7]。而酶法是利用蛋白酶將粗多糖中的蛋白質(zhì)水解，條件溫和，效率高[8]，但此法往往會引入新的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。所以與TCA法相結(jié)合可取得較好的效果。試驗以脫蛋白質(zhì)率和多糖損失率為指標，采用木瓜蛋白酶法結(jié)合TCA法研究米糠粗多糖脫蛋白工藝，通過對各工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件，以期為米糠粗多糖的純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 米糠 米糠購自湖北百信食品有限公司研發(fā)中心。

1.1.2 試劑 α-淀粉酶、木瓜蛋白酶購自廣州利源化工有限公司；葡萄糖、三氯乙酸、98%濃硫酸、75%乙醇、氯化鈉、氯化氫、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍均為分析純

1.1.3 儀器 UV-3000紫外可見分光光度計，上海精密儀器儀表有限公司；GLI66高速離心機， 上海申勝生物技術(shù)有限公司；DFY恒溫水浴鍋，武漢金寶華科技有限公司，RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；PL精密電子天平，梅特勒有限公司；LGJ-10D真空冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器有限公司；SHB循環(huán)水式多用真空泵， 上海貝侖儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠粗多糖干粉的制備[9] 制備流程見圖1。

1.2.2 脫蛋白試驗

1）木瓜蛋白酶法。取米糠粗多糖，配制成2 mg/mL粗多糖溶液，研究木瓜蛋白酶酶解時不同的酶添加量、溫度、pH、酶解時間對蛋白質(zhì)脫除率的影響。

2）三氯乙酸（TCA）法。經(jīng)酶解處理后的多糖樣品溶液40 mL，加入TCA。研究TCA的用量、作用次數(shù)、作用時間對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響。

1.2.3 測定方法 樣品蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮藍G-250法[10]，以牛血清蛋白作標準曲線；多糖含量測定采用苯酚-硫酸比色法[11]，以葡萄糖作標準曲線。

1.2.4 計算方法[12]

1）蛋白質(zhì)脫除率=（C1-C2）/C1×100%

式中，C1為脫色前的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL），C2為脫色后的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）。

2）多糖損失率=（A1-A2）/A1×100%

式中，A1為去除蛋白質(zhì)前原液中多糖含量，A2為去除蛋白質(zhì)后原液中多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶法脫蛋白影響因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶用量對米糠多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響 酶添加量分別為80、100、120、140、160、180 U/mL，pH為6，溫度為55 ℃，酶解時間為60 min。高溫滅酶活，離心，取上清測蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)脫除率，試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在酶的添加量為80～140 U/mL時，隨著酶添加量的增加，蛋白質(zhì)脫除率明顯增加；當酶的添加量為140 U/mL時，蛋白質(zhì)脫除率達到71.13%；當酶的添加量超過140 U/mL時，酶量的增加對蛋白質(zhì)脫除率影響很小。因此，確定140 U/mL為最適酶添加量。

2.1.2 酶解溫度對米糠多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響 酶解溫度分別為25、35、45、55、65、75 ℃，pH為6，酶添加量為140 U/mL，酶解時間為60 min。高溫滅酶活，離心，取上清測蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)脫除率，試驗結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在25～55 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶解速度加快，蛋白質(zhì)脫除率明顯提高，當酶解溫度達到55 ℃時，蛋白質(zhì)脫除率達到最大，為70.90%；當酶解溫度高于55 ℃時蛋白質(zhì)脫除率下降，可能是因為超過了酶作用的最適溫度后影響酶的活力。因此，選擇55 ℃為酶解最適溫度。

2.1.3 pH對米糠多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響 pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，酶添加量為140 U/mL，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為60 min。高溫滅酶活，離心，取上清測蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)脫除率，試驗結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當pH小于6.0時，蛋白質(zhì)脫除率隨pH的增大而增大；當pH達到6.0時，蛋白質(zhì)脫除率達到最大，為72.08%；當pH大于6.0時，蛋白質(zhì)脫除率隨pH的增大呈遞減的趨勢。這可能是pH影響了酶的活性。因此，選擇pH 6.0為最適酶解pH。

2.1.4 酶解時間對米糠多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響 酶添加量為140 U/mL，酶解溫度為55 ℃，pH 6.0，分別酶解30、40、50、60、70、80 min。高溫滅酶活，離心，取上清測蛋白質(zhì)含量，計算蛋白質(zhì)脫除率，試驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當酶解時間小于60 min時，隨著酶解時間的增加，蛋白質(zhì)脫除率明顯增加；當酶解時間達到60 min后，蛋白質(zhì)脫除率達到71.68%，當酶解時間超過60 min，酶解時間對蛋白質(zhì)脫除率影響不大。酶解反應時間和酶解進行程度有密切關(guān)系，反應時間太短酶解不充分；而當酶添加量達到一定量時，酶解反應時間的延長并不能使蛋白質(zhì)脫除率明顯提高。因此，選擇60 min為最佳酶解時間。

2.2 三氯乙酸法脫蛋白影響因素試驗結(jié)果

2.2.1 TCA用量對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取酶解處理后的多糖樣品溶液50 mL，分別加入4%、5%、6%、7%、8%、9%（與多糖樣品溶液的體積比，下同）的濃度為1.5 mol/L的TCA，混勻后60 ℃靜置30 min，3次重復，離心收集濾液，測定蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率，試驗結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，TCA用量的影響表現(xiàn)在兩個方面：增加TCA用量可以提高蛋白質(zhì)的脫除率，但多糖的損失率也在增加。當TCA用量小于6%時，隨著TCA用量的增加蛋白質(zhì)脫除率增加；當TCA用量為6%時，蛋白質(zhì)脫除率為85.64%，多糖損失率為12.31%，當TCA用量大于6%時，蛋白質(zhì)脫除率增加緩慢，而多糖損失率快速增加。當TCA用量為9%時，蛋白質(zhì)脫除率為88.42%，多糖損失率為21.60%。因此，選擇6%的TCA用量能對米糠多糖中蛋白質(zhì)達到較好的沉淀效果且多糖損失率較低。

2.2.2 TCA作用次數(shù)對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取酶解處理后的多糖樣品溶液50 mL，加入用量為6%的濃度為1.5 mol/L的TCA，混勻后60 ℃靜置30 min，作用5次，測量每次處理完后蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率，試驗結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，TCA處理次數(shù)對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率影響不盡相同。TCA作用1次時，蛋白質(zhì)脫除率只有42.13%，多糖損失率為4.32%；作用兩次時，蛋白質(zhì)脫除率達到59.28%，多糖損失率為8.78%；作用3次時，蛋白質(zhì)脫除率達到85.62%，多糖損失率為11.14%；作用4～5次，蛋白質(zhì)脫除率增加不明顯，而多糖損失率仍增加。因此，TCA作用3次是脫除蛋白質(zhì)最佳處理次數(shù)。

2.2.3 TCA處理時間對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響 取酶解處理后的多糖樣品溶液50 mL，加入用量為6%的濃度為1.5 mol/L的TCA，3次重復，處理時間分別設定為10、20、30、40、50、60 min，測量每次處理完后蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率，試驗結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，TCA處理時間對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率有明顯影響。當TCA作用時間小于30 min時，蛋白質(zhì)脫除率隨時間增加而明顯增加；當TCA作用時間為30 min時，蛋白質(zhì)脫除率為85.52%，多糖損失率為11.20%；當TCA處理時間大于30 min時，蛋白質(zhì)脫除率增加緩慢，而多糖損失率明顯增加。因此，選擇TCA處理30 min能對米糠多糖中蛋白質(zhì)達到較好的沉淀效果且多糖損失率較低。

3 結(jié)論

多糖脫蛋白并不是徹底地去除蛋白，主要是脫除游離蛋白。在選擇脫蛋白的方法上需注意避免多糖結(jié)構(gòu)的破壞和多糖特有生理活性的下降，選擇合適的蛋白質(zhì)脫除劑和合適的工藝條件對保持多糖得率和提高蛋白質(zhì)脫除效果至關(guān)重要[13，14]。木瓜蛋白酶和TCA試劑相結(jié)合法能較好地脫除米糠粗多糖中的蛋白質(zhì)。通過試驗可知，木瓜蛋白酶脫除米糠粗多糖蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為酶添加量140 U/mL，酶解最適溫度55 ℃，酶解最適pH 6.0，酶解時間60 min。此條件下蛋白質(zhì)脫除率為71.68%。米糠多糖的酶解液再以用量為6%的1.5 mol/L TCA作用30 min，重復3次，此時蛋白質(zhì)脫除率為85.52%，多糖損失率為11.20%。

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