滅多威對(duì)MDEC—07114細(xì)胞周期及Cyclin—D1的影響

摘要：為探討滅多威對(duì)家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114細(xì)胞周期及細(xì)胞周期蛋白Cyclin-D1的影響，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度滅多威對(duì)MDEC-07114細(xì)胞周期的影響，應(yīng)用免疫組化S-P法（Streptavidin-perosidase）檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白Cyclin-D1表達(dá)。結(jié)果表明滅多威作用于MDEC-07114后，各濃度組G0/G1期升高，S+G2/M期細(xì)胞占比及PI降低；從滅多威1 mg/mL處理組開始Cyclin-D1表達(dá)出現(xiàn)降低，且隨濃度的增加降幅增大?？梢姕缍嗤梢酝ㄟ^下調(diào)Cyclin-D1使細(xì)胞周期阻滯而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：MDEC-07114細(xì)胞；滅多威；細(xì)胞周期；Cyclin-D1

中圖分類號(hào)：Q965.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-4949-02

Effects of Methomyl on Cell Cycle and Cyclin-D1 of MDEC-07114 Cell

LIU Liu，HE Li-fang，LIU Hui，HUANG Xue-gui，ZHANG Xi

（Department of Parasitology， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）

Abstract： To investigate the effects of Methomyl on cell cycle and cyclin-D1 of MDEC-07114 Cell， experiments were conducted to measure the effects on cell cycle with flow cytometry and expression of cyclin-D with immunohistochemical S-P method. For the MDEC-07114 cell under Methomyl， the percentage of G0/G1 was increased while the percentage of S+G2/M and the cell proliferation index were obviously reduced at the all concentration-groups. From the 1mg/mL groups of Methomyl， the expression of cyclin-D1 was reduced with the increase of the concentration.Therefore， the growth of MDEC-07114 may be inhibited by reducing expression of cyclin-D1 to block cell cycle.

Key words： MDEC-07114 cell； Methomyl； cell cycle； Cyclin-D1

MDEC-07114是遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)課題組自建的家蠅胚胎細(xì)胞系，滅多威為氨基甲酸酯類殺蟲劑，對(duì)昆蟲卵有殺傷作用，對(duì)家蠅也有毒殺作用，前期研究表明滅多威對(duì)體外培養(yǎng)的MDEC-07114細(xì)胞有抑殺作用[1]。家蠅抗藥性問題日趨嚴(yán)重，尋找新的殺蟲劑成為必然。昆蟲細(xì)胞凋亡的研究是探討昆蟲殺蟲劑作用機(jī)制、尋找昆蟲防治新途徑的探索和嘗試。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)[2-4]。本試驗(yàn)研究滅多威對(duì)MDEC-07114的細(xì)胞周期及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響，為新的昆蟲防治方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細(xì)胞 家蠅胚胎細(xì)胞系MDEC-07114，由遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供。

1.1.2 滅多威溶液 滅多威[含量99.9%，批號(hào)BW（E）060546] 購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，丙酮（分析純）購自成都化學(xué)試劑廠。先用無血M3培養(yǎng)基溶解丙酮，配制成1%丙酮溶液，抽濾，4 ℃保存。然后用1%丙酮溶液溶解滅多威，混勻抽濾配成20 mg/mL滅多威母液，4 ℃保存。使用時(shí)用1%丙酮溶液稀釋成不同濃度供試驗(yàn)用。

1.1.3 碘化丙啶溶液 將碘化丙啶（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)）溶于PBS中，終濃度為100 mg/mL，含RNase 100 μg/mL，4 ℃避光保存。

1.1.4 免疫組化S-P法試劑 SP-0023免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、Anti-Cyclin D1均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.5 主要儀器 FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司生產(chǎn)），奧林巴斯-CX31顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 MDEC-07114細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮凍存的MDEC-07114復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中，28 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)[5]。采用直接吹打法傳代，每隔3 d傳代一次，生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)分組 試驗(yàn)組，滅多威濃度分別為1、2、4 mg/mL；丙酮組，1%丙酮；正常組，作為對(duì)照，不加藥劑。3個(gè)平行。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 在塑料培養(yǎng)瓶中接種細(xì)胞懸液4 mL（每毫升細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)），28 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行同步化處理，24 h后棄上清液，加含不同濃度滅多威的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，正常組加等量的培養(yǎng)基，24 h后收集細(xì)胞，500 r/min離心5 min，PBS洗1次，離心棄上清液，PBS重懸細(xì)胞，400目尼龍網(wǎng)過濾，500 r/min離心5 min，棄PBS后加入碘化丙啶染液，4 ℃避光2 h后上機(jī)測(cè)各細(xì)胞周期細(xì)胞占比。根據(jù)所得的數(shù)值計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)（Proliferative index，PI）：

PI=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%。

1.2.4 免疫組化S-P法檢測(cè)Cyclin-D1 接種細(xì)胞于有蓋片（PLL包被）的6孔板中（細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)/mL，1 000 μL/孔），24 h后棄上清液，加入含有不同濃度滅多威的培養(yǎng)基，正常組加等量的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)PBS組作為陰性對(duì)照組，各組設(shè)3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后取出蓋片，4%多聚甲醛固定后按照SP免疫組化染色試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.5 免疫組化結(jié)果分析 Cyclin-D1免疫組化以細(xì)胞核及胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。每張玻片選擇10個(gè)視野進(jìn)行圖像采集，采用IPWIN60軟件進(jìn)行灰度分析，測(cè)定陽性染色面積（A）、平均光密度（M）以及積分光密度（IOD），以各組平均IOD值作為最終計(jì)算結(jié)果。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，單因素方差分析，t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞周期測(cè)定

各處理的各細(xì)胞周期細(xì)胞占比及增殖指數(shù)見表1。滅多威1 mg/mL組、正常組以及丙酮組MDEC-07114的G0/G1期和S+G2/M期細(xì)胞占比均無顯著差異（P>0.05）。2 mg/mL組、4 mg/mL組MDEC-07114細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞占比升高，S+G2/M期細(xì)胞占比降低，細(xì)胞增殖指數(shù)PI降低，3項(xiàng)指標(biāo)與正常組比差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。

2.2 Cyclin-D1表達(dá)

鏡下觀察可見，正常組中Cyclin-D1陽性表達(dá)細(xì)胞最多，顏色呈棕黃色。隨藥物濃度增加陽性表達(dá)細(xì)胞減少，顏色逐漸變淡。正常組細(xì)胞IOD值最高，從滅多威1 mg/mL組開始減少，隨藥物濃度的增加IOD值逐漸降低（表2），藥劑處理組與正常組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

在細(xì)胞周期中，至少有兩個(gè)節(jié)點(diǎn)控制細(xì)胞能否進(jìn)入下一個(gè)時(shí)相，節(jié)點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展，與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。一個(gè)位于G1/S處，另一個(gè)位于G2/M處[6]。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的因子大致可分為細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（CDI）[7]。Cyclin-D是果蠅中惟一的D型周期蛋白，推動(dòng)細(xì)胞分裂[8]。哺乳動(dòng)物的D型細(xì)胞周期蛋白有Cyclin-D1、Cyclin-D2、Cyclin-D3三種，Cyclin-D1可通過激活CDK4推動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期[9]。

流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，滅多威2、4 mg/mL組可引起MDEC-07114細(xì)胞G0/G1期占比升高，S+G2/M期占比降低，PI降低。提示滅多威可致MDEC-07114細(xì)胞的G0/G1期阻滯，細(xì)胞增殖受到影響。S-P法檢測(cè)結(jié)果顯示，從1 mg/mL組開始Cyclin-D1陽性表達(dá)細(xì)胞開始減少，隨藥物濃度增加陽性表達(dá)細(xì)胞逐漸減少，顏色逐漸變淡。隨藥物濃度的增加IOD也逐漸降低，滅多威作用于MDEC-07114細(xì)胞后，Cyclin-D1表達(dá)減少。Cyclin-D1是G1期細(xì)胞周期蛋白，在G1期存在并大量表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)減少，必然引起細(xì)胞周期的G1期阻滯，細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響。前期研究證實(shí)一定濃度的滅多威可以抑制MDEC-07114細(xì)胞生長(zhǎng)，結(jié)合本研究推測(cè)，滅多威可能通過下調(diào)Cyclin-D1，使細(xì)胞周期阻滯而抑制MDEC-07114細(xì)胞生長(zhǎng)，Cyclin-D1參與家蠅胚胎細(xì)胞周期調(diào)控。細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡相關(guān)，滅多威是否可以誘導(dǎo)MDEC-07114細(xì)胞凋亡有待進(jìn)一步研究。

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