摘要:以草莓新品種晶玉為試材,研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和配比對(duì)其葉片、葉柄再生的影響及不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)葉片再生的影響,并篩選出了最佳的生根培養(yǎng)基,建立了晶玉的高效離體再生體系。結(jié)果表明,培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D對(duì)晶玉葉片不定芽的分化效果最好,平均不定芽再生率可達(dá)81.45%,每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到4.47個(gè);暗培養(yǎng)7 d有利于葉片不定芽的再生。培養(yǎng)基MS+3.0 mg/L TDZ +0.05 mg/L 2,4-D對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的效果最好。最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA。
關(guān)鍵詞:草莓;晶玉;離體再生;葉片;葉柄
中圖分類號(hào):S668.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2013)23-5912-05
晶玉是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所以甜查理為母本,晶瑤為父本雜交選育的草莓新品種,于2012年通過(guò)湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)的審定[1]。該品種具有品質(zhì)較優(yōu)、抗炭疽病和白粉病、豐產(chǎn)性好等優(yōu)勢(shì),是生產(chǎn)上很有潛力的一個(gè)栽培品種。建立其高效的再生體系,對(duì)于草莓品種的種質(zhì)交換及進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義[2,3]。
國(guó)內(nèi)外對(duì)草莓的組織培養(yǎng)再生研究已有一些報(bào)道,主要集中在對(duì)草莓莖尖快速繁殖,不同品種的葉片、葉柄、花藥不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相關(guān)研究中涉及的品種主要是豐香、晶瑤、Tudla、全明星、紅顏等[7-12],但具有高效再生體系的優(yōu)良草莓品種仍然較少,有必要進(jìn)一步對(duì)新審定的草莓品種進(jìn)行高效再生體系研究。本研究以晶玉葉片、葉柄為試材,研究了不同激素濃度和配比對(duì)葉片、葉柄不定芽分化的影響,暗處理對(duì)不定芽分化的影響等,建立了草莓新品種晶玉的高效離體再生體系。
1 材料與方法
1.1 供試材料
供試材料為草莓新品種晶玉,2011年4月種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所草莓試驗(yàn)圃,6月在田間選取健壯草莓母株上,生長(zhǎng)充實(shí)而小葉尚未展開的匍匐莖頂端約3~4 cm長(zhǎng)的頂芽。
1.2 無(wú)菌材料的獲得
將匍匐莖頂芽用自來(lái)水沖洗干凈并擦干,轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái),按下列程序消毒。70%酒精浸潤(rùn)30 s,無(wú)菌水沖洗1次,然后用0.1% HgCl2消毒10 min,無(wú)菌水沖洗5次。將處理好的頂芽在無(wú)菌紙上逐層剝?nèi)ビ兹~取出莖尖生長(zhǎng)點(diǎn),接于MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng),培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃、光照度1 500~2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d(下同)。莖尖在MS培養(yǎng)基上成活后,在MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)1次,以25 d苗齡無(wú)菌試管苗的葉片、葉柄為試驗(yàn)材料。
1.3 不同濃度6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
取長(zhǎng)勢(shì)健壯、三出復(fù)葉均展開的晶玉無(wú)菌試管苗葉片,去除葉片邊緣部分,切成5 mm×5 mm左右的小塊狀葉盤,以近軸面向下與再生培養(yǎng)基接觸進(jìn)行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L 蔗糖(Sucrose)+ 2.5 g/L 菲特膠(Phytagel)為基本培養(yǎng)基,pH 5.8,分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IAA激素配比,50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),研究不同濃度的6-BA與IAA組合對(duì)晶玉草莓葉片不定芽再生的影響。每個(gè)處理80片葉,每處理3次重復(fù)。接種后培養(yǎng)條件為:溫度(25±2) ℃、光照度 1 500~2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d(除暗培養(yǎng)外,下同)。
1.4 不同濃度TDZ與2,4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
同“1.3”的接種培養(yǎng)方法,以MS+ 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基,pH 5.8,分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的噻苯?。═DZ,Thidiazuron)與0.05、0.10、0.20 mg/L 的2,4-D激素配比,50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),研究不同濃度的TDZ與2,4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。
1.5 不同濃度TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
同“1.3”的接種培養(yǎng)方法,以MS+30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基, pH 5.8,分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的TDZ與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IBA激素配比,50 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),研究不同濃度的TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。
1.6 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
以MS + 2.0 mg/L TDZ + 0.05 mg/L 2,4-D + 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為培養(yǎng)基,pH 5.8,葉盤接種后在(25±2) ℃條件下,分別進(jìn)行0、7、14、21、28 d的暗處理,在光照度1 500~2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d的條件下培養(yǎng),研究不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響。每個(gè)處理80片葉,每處理3次重復(fù)。
1.7 不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響
取長(zhǎng)勢(shì)健壯、三出復(fù)葉均展開的晶玉無(wú)菌試管苗葉柄,切成1 cm左右的小段與再生培養(yǎng)基接觸進(jìn)行培養(yǎng)。再生培養(yǎng)基以MS+30 g/L Sucrose+2.5 g/L Phytagel為基本培養(yǎng)基,pH 5.8,分別添加不同濃度的TDZ與2,4-D或IBA的配比,50 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì),研究不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響。每個(gè)處理80個(gè)葉柄切段,每處理3次重復(fù)。接種后培養(yǎng)條件為:溫度(25±2) ℃、光照度1 500~2 000 lx、光照時(shí)間16 h/d。
1.8 晶玉的再生小苗生長(zhǎng)與植株生根
將再生的晶玉不定芽在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA上繼代培養(yǎng)1次,當(dāng)不定芽長(zhǎng)至3 cm左右時(shí),將生長(zhǎng)健壯的無(wú)根小苗接種于不同生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng),25 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。通過(guò)生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均根粗等指標(biāo)綜合衡量晶玉的最佳生根培養(yǎng)基。
1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
在不定芽再生過(guò)程中,持續(xù)觀察外植體形態(tài)變化及不定芽再生情況。培養(yǎng)50 d后,統(tǒng)計(jì)不同處理不定芽再生頻率和每個(gè)外植體再生的不定芽個(gè)數(shù),計(jì)算不定芽再生率及每個(gè)外植體再生芽數(shù)。
不定芽再生頻率=再生出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%
每個(gè)外植體再生芽數(shù)=外植體再生出的不定芽總數(shù)/再生出不定芽的外植體數(shù)
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行分析,應(yīng)用SAS 8.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同濃度6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
晶玉葉盤接種于添加了6-BA與IAA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上,愈傷產(chǎn)生量少,且愈傷多為淺綠色、質(zhì)地較致密堅(jiān)硬,30 d左右不定芽開始分化。大部分不定芽經(jīng)愈傷組織分化形成,少量不定芽直接在葉片切口末端形成。如表1所示,不同濃度的6-BA與IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的試驗(yàn)中,該組合總體上能夠誘導(dǎo)葉片不定芽的再生,但再生頻率較低。其中2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生相對(duì)較好,再生率達(dá)到19.05%,與其他處理間差異顯著。
2.2 不同濃度TDZ與2,4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
從表2可以看出,在同一TDZ水平上,晶玉葉片不定芽再生率隨著2,4-D濃度的升高呈顯著下降的趨勢(shì),這說(shuō)明培養(yǎng)基中附加低濃度(小于0.10 mg/L)的2,4-D有利于晶玉葉片不定芽的再生。葉片接種于添加了TDZ與2,4-D不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上,產(chǎn)生愈傷多為黃綠色顆粒狀,質(zhì)地較致密,25 d左右開始形成不定芽。結(jié)果表明,2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生最好,再生率達(dá)到81.45%,顯著高于其他處理,平均再生芽數(shù)達(dá)到4.47個(gè)。3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D組合不定芽再生率也較高,但觀察發(fā)現(xiàn),當(dāng)TDZ濃度較高時(shí)(大于2.0 mg/L),再生出的不定芽玻璃化嚴(yán)重,因此TDZ濃度不宜過(guò)高,以2.0 mg/L為宜。如圖1所示,圖1a為晶玉葉片接種7 d后在切口邊緣形成明顯的黃綠色愈傷,圖1b為晶玉葉片愈傷再生出的不定芽。
2.3 不同濃度TDZ與IBA組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
在TDZ與IBA不同濃度組合的再生培養(yǎng)基上,晶玉葉片多產(chǎn)生黃綠色顆粒狀愈傷、少量為塊狀,質(zhì)地致密,30 d左右開始形成不定芽。從表3可以看出,2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA組合對(duì)培養(yǎng)晶玉葉片不定芽再生效果最好,平均不定芽再生率達(dá)到55.96%,顯著高于其他處理,每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到3.55個(gè);當(dāng)TDZ濃度進(jìn)一步提高到3.0 mg/L時(shí),不定芽再生率開始下降,且不定芽以叢生狀為主,長(zhǎng)勢(shì)較弱,玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。
2.4 不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響
不同暗培養(yǎng)時(shí)間對(duì)晶玉葉片不定芽再生的影響如表4所示。暗培養(yǎng)7 d平均不定芽再生率最高,達(dá)到84.53%,每個(gè)外植體再生芽數(shù)達(dá)到5.01個(gè),顯著高于沒有暗培養(yǎng)的處理,表明暗培養(yǎng)對(duì)晶玉葉片不定芽的再生有一定促進(jìn)作用。觀察發(fā)現(xiàn),進(jìn)行7 d暗培養(yǎng),可以減輕晶玉葉片切口的褐化現(xiàn)象,這可能是暗培養(yǎng)促進(jìn)不定芽再生的主要原因。但暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于不定芽的分化再生。
2.5 不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響
不同濃度激素配比對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的影響結(jié)果如表5所示。在13種激素組合中,3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D組合對(duì)晶玉葉柄不定芽再生效果最好,平均不定芽再生率達(dá)到57.83%,顯著高于其他處理,每葉塊平均再生芽數(shù)達(dá)到3.59個(gè)。晶玉葉柄不定芽再生如圖1所示,其中圖1c為晶玉葉柄接種7 d后在切段兩端形成明顯的黃綠色塊狀愈傷,圖1d為葉柄愈傷再生不定芽。
2.6 不同生根培養(yǎng)基對(duì)晶玉植株生根的影響
再生出來(lái)的晶玉不定芽在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)1次后生長(zhǎng)成小植株,如圖1e所示。在如表6所示的7種生根培養(yǎng)基中,從各項(xiàng)指標(biāo)綜合考慮,晶玉的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA,其生根率、平均生根數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均根粗分別達(dá)到了99.33%、11.67個(gè)、3.04 cm、0.80 mm。晶玉不定芽生根形成的完成植株如圖1f所示。
3 小結(jié)與討論
影響草莓再生的因素較多,其中草莓品種自身特性、培養(yǎng)基、不同激素的種類和濃度配比等是關(guān)鍵因子。近幾年,湖北省草莓育苗期炭疽病病害發(fā)生嚴(yán)重[13],而晶玉是一個(gè)對(duì)炭疽病具有較高抗性的品種,其在生產(chǎn)上應(yīng)用潛力較大。晶玉高效的再生體系對(duì)于種質(zhì)交換及進(jìn)一步的草莓遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。
激素種類和配比是影響外植體器官發(fā)生的重要因素。在離體培養(yǎng)中一般生長(zhǎng)素有利于根的形成,而細(xì)胞分裂素有利于芽的形成,通過(guò)改變二者的比例可以調(diào)節(jié)芽的形成。在不同類型的激素組合中,以TDZ與2,4-D配合使用時(shí)晶玉再生頻率較高,這可能與TDZ強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂素活性有關(guān)。本試驗(yàn)建立了晶玉的高效離體再生體系,2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D組合對(duì)晶玉葉片不定芽再生的效果最好,再生率達(dá)到81.45%;3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2,4-D組合對(duì)晶玉葉柄不定芽再生的效果最好,再生率達(dá)到57.83%。
暗培養(yǎng)也是影響草莓葉片再生率高低的重要因素之一。有相關(guān)報(bào)道指出[9,14,15],草莓不同品種再生所需要的合適的暗培養(yǎng)時(shí)間各有不同,草莓豐香的最佳暗培養(yǎng)時(shí)間是14 d,草莓吐德拉是21 d,草莓幸香是42 d。本研究結(jié)果表明,晶玉葉片再生最佳的暗培養(yǎng)時(shí)間是7 d。暗培養(yǎng)的主要作用是讓外植體在再生過(guò)程中減少溢出酚類物質(zhì),減輕褐化,維持植物材料較好的生理狀態(tài)[16,17],因而有利于再生。
參考文獻(xiàn):
[1] 向發(fā)云,曾祥國(guó),馮小明,等.草莓新品種‘晶玉’[J].園藝學(xué)報(bào),2012,39(12):2523-2524.
[2] GRUCHALA A,MALGORZATA K,EDWARD Z.Conditions of transformation and regeneration of‘Induka’ and ‘Elista’ strawberry plants[J]. Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2004,79:153-l60.
[3] 尹淑萍,金萬(wàn)梅,王 萍,等.Thidiazuron對(duì)草莓外植體再生不定芽的影響[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2003,11(4):379-382.
[4] 鳳 婷,趙密珍,王 鈺,等.草莓品種寧玉再生體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,29(3):688-690.
[5] 向發(fā)云,曾祥國(guó),馮小明,等.影響‘豐香’草莓花藥培養(yǎng)再生的幾個(gè)主要因素[A].張運(yùn)濤.草莓研究進(jìn)展(三)[C].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2010.43-47.
[6] 張志宏,吳祿平,代紅艷,等.草莓主栽品種再生和轉(zhuǎn)化的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2001,28(3):189-193.
[7] 秦永華,張上隆,徐 凱,等.‘豐香’草莓葉片高效再生體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(1):189-193.
[8] 向發(fā)云,吳金平,曾祥國(guó),等.“晶瑤”草莓葉片再生體系的建立[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,22(11):28-31.
[9] 吳雪梅,湯浩茹,文國(guó)琴,等.不同培養(yǎng)條件對(duì)‘豐香’草莓離體葉片再生的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2004,31(5):657-659.
[10] 張志宏,吳祿平.草莓主栽品種Tudla遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1998(6):200-204.
[11] 張紅梅,王俊麗.‘全明星’草莓葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].生物技術(shù),2005(15):68-70.
[12] 董 莉,晁慧娟,董清華,等.紅顏草莓葉片再生體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010(26):246-249.
[13] 向發(fā)云,韓永超,曾祥國(guó),等.湖北省草莓育苗期炭疽病病害調(diào)查[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(24):5650-5653.
[14] 孟 楠,劉月學(xué),孫立茹,等.‘吐德拉’草莓葉片離體再生體系的建立[A].張運(yùn)濤.草莓研究進(jìn)展(三)[C].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2010.48-52.
[15] 周厚成,羅 靜,趙 霞,等.不同培養(yǎng)條件對(duì)幸香草莓離體葉片再生的影響[J].果樹學(xué)報(bào),2007,24(1):105-108.
[16] 向發(fā)云,曾祥國(guó),馮小明,等.草莓葉柄組織培養(yǎng)再生研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,49(2):273-275.
[17] TIAN M,GU Q,ZHU M Y.The involvement of hydrogen of peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus[J]. Plant Science,2003, 165(4):701-707.