植物生長調(diào)節(jié)劑對槲蕨離體培養(yǎng)的效

摘要：以不同來源的槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]孢子、塊莖、葉片為試驗(yàn)材料，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA、2，4-D、NAA、IBA等激素，研究植物生長調(diào)節(jié)劑對槲蕨離體培養(yǎng)的效應(yīng)。結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的2，4-D對槲蕨愈傷組織誘導(dǎo)有良好的促進(jìn)作用，且愈傷組織較大、嫩綠、質(zhì)量好，愈傷組織誘導(dǎo)最佳激素組合為1.0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)率為53.3%；最佳分化培養(yǎng)基為1.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L KT，分化率為75.0%；繼代增殖中6-BA與NAA配比有較好的效果，最適增殖培養(yǎng)基為2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA，最高增殖倍數(shù)可達(dá)2.25倍；最佳生根壯苗培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA。

關(guān)鍵詞：植物生長調(diào)節(jié)劑；槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]；離體培養(yǎng)；效應(yīng)

中圖分類號：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5909-03

槲蕨[Drynaria fortunei （Kunze） J.Sm]為槲蕨科（Drynariaceae）槲蕨屬（Drynaria）植物，其根莖是中藥骨碎補(bǔ)的主要來源，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛等功效，常用于治療腎虛腰痛、耳鳴耳聾、牙齒松動、跌撲閃挫、筋骨折傷、外治斑禿及白癜風(fēng)[1]等疾病。槲蕨的多糖還具有一定的抗細(xì)菌和真菌活性[2]。以槲蕨為原料的強(qiáng)骨膠囊已獲國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的中藥二類新藥證書和生產(chǎn)批文并開始生產(chǎn)[1]。槲蕨主要分布在長江以南各省，附生于低山丘陵的巖石或樹干上。槲蕨分布和數(shù)量相對較少，但需求量大，槲蕨占骨碎補(bǔ)商品藥材的70%以上[3]。近年來，隨著人們保健意識的增強(qiáng)，對原料的需求急劇增加，加上生態(tài)環(huán)境的變化和骨碎補(bǔ)的大量被采挖，使該植物的種類和數(shù)量越來越少，在一些地區(qū)骨碎補(bǔ)瀕危滅絕，野生槲蕨緊缺。目前，國內(nèi)外對槲蕨的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理及生藥鑒定等方面，有關(guān)于消毒方式、光照度等對槲蕨組培快繁的影響的報道[4-6]，而對槲蕨不同部位離體培養(yǎng)的研究報道較少。本試驗(yàn)通過研究植物生長調(diào)節(jié)劑對槲蕨不同部位外植體離體培養(yǎng)的效應(yīng)，旨在為槲蕨的組培快繁以及開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料槲蕨孢子、塊莖采自廣西武鳴縣、玉林市及四川等地。2011年4月11日于廣西藥用植物園離體庫進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 取槲蕨幼嫩孢子、塊莖、葉片，先用洗潔精水溶液清洗塊莖表面污垢，清除塊莖表皮毛，置于燒杯中流水沖洗15 min，用軟毛刷輕輕去除表面塵土，然后移至超凈工作臺上，用75%乙醇滅菌25～30 s，無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水浸泡4次，每次5 min。用備用的無菌濾紙吸干外植體表面的水分后，剪切成大小約1.0 cm×0.6 cm、厚為0.2～0.3 cm的塊莖，葉片大小為1.0 cm×0.6 cm，平放到培養(yǎng)基上，孢子用消毒好的解剖刀從葉片上刮到培養(yǎng)基中，塊莖和葉片每瓶接種2～4個外植體。每處理接種20瓶，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇 愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)基是以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)不同激素配比共12種，分別為：（0.5、1.0） mg/L 6-BA +（0.5、1.0、1.5）mg/L 2，4-D；（0.5、1.0） mg/L 6-BA+（0.1、0.5、1.0）mg/L KT；繼代增殖培養(yǎng)基設(shè)不同激素配比10種，分別為：（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA；2.0 mg/L 6-BA +（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0）mg/L NAA；生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)不同激素配比4種，分別為：0.5 mg/L IBA、0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L IAA、0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA。

1.2.3 培養(yǎng)條件 接種后，在溫度20～25 ℃、光照度20～30 μmol/（m2·s）、光照時間12 h/d的條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)分化、繼代增殖與壯苗生根培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素水平對槲蕨愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采用12種不同的激素配比對消毒好的槲蕨幼嫩孢子、塊莖、葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及分化，首先將外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖1A），再對愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)（圖1B）。經(jīng)試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，孢子培養(yǎng)（圖1C）7 d左右開始呈綠色，隨后便長出大小不一的葉叢（圖1D）；葉片則逐漸褐化；只有塊莖產(chǎn)生愈傷組織。塊莖愈傷組織誘導(dǎo)效果見表1。

從表1可以看出，A1-A12處理均能使槲蕨誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織并分化，A1-A6處理是0.5、1.0 mg/L 6-BA分別與0.5、1.0、1.5 mg/L 2，4-D配合使用，其中1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L 2，4-D配對組合槲蕨愈傷組織誘導(dǎo)率較高，為53.3%，愈傷組織嫩綠（圖1A）；繼續(xù)培養(yǎng)5～10 d愈傷組織便可分化出葉叢（圖1B）。

A7-A12處理是0.5、1.0 mg/L 6-BA分別與0.1、0.5、1.0 mg/L KT配合使用，槲蕨產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)較少，最高愈傷組織誘導(dǎo)率僅為35.7%，相對而言，愈傷組織質(zhì)量變差，部分出現(xiàn)淺黃色或褐化現(xiàn)象。可見，適當(dāng)濃度的2，4-D對槲蕨愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于KT。而在分化培養(yǎng)中，KT對槲蕨愈傷組織的分化起到促進(jìn)作用，其最高分化率可達(dá)75.0%。

2.2 不同激素水平對槲蕨苗繼代增殖的影響

均等切分誘導(dǎo)出的槲蕨葉叢，將其接種在含不同外源激素水平的增殖培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計(jì)和觀察增殖情況。試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA配合使用對槲蕨葉叢的增殖有明顯的促進(jìn)作用。在0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 6-BA的濃度梯度范圍內(nèi)，槲蕨葉叢增殖系數(shù)不斷增加，試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)在B7培養(yǎng)基上槲蕨繼代苗生長良好，葉片濃綠，苗生長較整齊一致（圖1E），且增殖倍數(shù)達(dá)到最大，為2.25倍；在6-BA濃度不變的情況下，隨著NAA濃度的增加，槲蕨葉叢增殖系數(shù)呈下降趨勢，且苗質(zhì)量變差，葉片枯黃現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

2.3 不同激素水平對槲蕨繼代苗生根的影響

將槲蕨繼代苗接入含不同外源激素水平的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，20 d后觀察，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果得出4種生根培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)情況，槲蕨根粗大小依次為D4、D3、D2、D1；4種生根培養(yǎng)基的苗都呈濃綠色，有少數(shù)苗根部枯黃，生根率均達(dá)90%以上。從表3可以看出，NAA誘導(dǎo)出的根無論根粗和苗高都優(yōu)于IBA，激素NAA和IAA配比對槲蕨壯苗生根的效果較好，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/LNAA+0.3 mg/L IAA。

2.4 試管苗的移栽

經(jīng)過壯苗生根培養(yǎng)后，選擇健壯、根粗的試管苗進(jìn)行煉苗。打開培養(yǎng)瓶的蓋子，噴施少量水，放入溫室內(nèi)自然光下煉苗7 d，用鑷子取出試管苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)約為5～8 cm厚的泥炭土、樹皮等基質(zhì)中，基質(zhì)以排水良好、不易發(fā)霉為宜。移栽至苗較粗壯，長勢旺盛時，可移植到樹上（圖1F）。

3 小結(jié)與討論

本研究分別采用槲蕨孢子、塊莖和葉片進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)對比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)孢子放到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，出現(xiàn)綠點(diǎn)進(jìn)而形成葉叢團(tuán)；塊莖能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織誘導(dǎo)率較低；葉片在誘導(dǎo)過程中易褐化，未產(chǎn)生愈傷組織。

植物生長調(diào)節(jié)劑對槲蕨的離體培養(yǎng)有較大影響，此外，離體培養(yǎng)還受光照、溫度、活性炭等因素的影響，適當(dāng)調(diào)整光暗條件進(jìn)行培養(yǎng)對于塊莖愈傷組織的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，本試驗(yàn)在槲蕨愈傷組織誘導(dǎo)初期進(jìn)行了光暗交替培養(yǎng)，對于愈傷組織的產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在添加活性炭之前，槲蕨苗培養(yǎng)1個月后底部逐漸黃化或褐化，苗細(xì)弱；添加活性炭以后，槲蕨苗褐化現(xiàn)象少，且幼苗健壯。說明活性炭有利于壯苗及抑制褐化。

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