茅莓黃酮體外抗氧化活性研究

摘要：為了研究茅莓（Rubus parvifolius L.）不同部位（根、莖、葉）中總黃酮的體外抗氧化活性，試驗分別考察了茅莓根、莖、葉中總黃酮對羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子（O2-）、有機(jī)自由基（DPPH·）的清除能力及對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物丙二醛（MDA）的抑制率。結(jié)果表明，茅莓各部位黃酮在一定濃度范圍內(nèi)，其清除羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子（O2-）、有機(jī)自由基（DPPH·）及抑制MDA的作用均呈量效關(guān)系。說明茅莓根、莖、葉中總黃酮均具有一定的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：茅莓（Rubus parvifolius L.）；總黃酮；抗氧化活性

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5828-04

茅莓（Rubus parvifolius L.）又名紅梅消、天青地白草等，系薔薇科懸鉤子屬植物茅莓（Rubus parvifolius L.）的干燥全草。本品為民間常用草藥，落葉小灌木，生于山坡、路旁荒地、灌叢和草叢中，適應(yīng)性強(qiáng)，資源十分豐富，分布于河北、山西、陜西、四川以及中南和華東各省[1]。茅莓根、莖、葉均可作藥用，具有清熱涼血、止血、散結(jié)止痛、利尿消腫等功效[2]，其化學(xué)成分有皂苷[3，4]、黃酮[5]、酚酸類物質(zhì)[6]、萜類[7]以及揮發(fā)油[8]等多種成分。研究發(fā)現(xiàn)茅莓根、莖、葉中均含有黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物具有良好的抗氧化性能，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老和增加機(jī)體免疫力、降血壓、降血脂、增進(jìn)冠狀動脈血流量、軟化血管和防治冠心病、心絞痛及抗腫瘤等功能[8-11]。茅莓的諸多功效與其所含的黃酮類化合物有著密切的聯(lián)系，目前鮮見對茅莓不同部位總黃酮抗氧化活性的研究報道。本試驗通過對茅莓根、莖、葉總黃酮體外抗氧化活性的研究，旨在為茅莓資源進(jìn)一步合理綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茅莓采自山東煙臺昆崳山國家級自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院劉孟安教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）植物茅莓的干燥全草，參照文獻(xiàn)[12]中采用正交試驗優(yōu)化的茅莓總黃酮提取工藝分別提取茅莓根、莖、葉中的黃酮。試驗動物為SD雄性大鼠，SPF級，體重200 g左右，由山東綠葉制藥有限公司提供。丙二醛（MDA）測試盒和總蛋白定量測試盒（BCA法）由南京建成生物工程研究所提供，批號分別為20110729、20110804；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），純度>96%，由阿拉丁試劑公司提供；Tris堿（AMRESCO）；水（娃哈哈牌純凈水）；乙醇、石油醚（30～60 ℃）、濃鹽酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、雙氧水等均為國產(chǎn)分析純。儀器有TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計、FA1604s型電子天平、KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器、PHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、臺式高速冷凍離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 茅莓總黃酮的提取 分別精確稱取茅莓根、莖、葉粉末各1.0 g，參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行總黃酮的提取。得到茅莓根、莖、葉總黃酮提取率分別為3.02、5.00、12.50 mg/g。

1.2.2 茅莓莖總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用[13] 空白對照管：取2.0 mL的PBS（pH 7.4，下同）溶液和4.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。未損傷管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL鄰二氮菲（1.5 mmol/L，下同）、1.0 mL FeS04 溶液（1.5 mmol/L，下同）和2.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。損傷管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL FeS04溶液、1.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.02% H2O2于試管中，混勻。樣品參比管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液和3.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。樣品管：取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL FeSO4溶液、1.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液和1.0 mL 0.02% H2O2于試管中，混勻。將上述試管置于恒溫水槽中，37 ℃保溫60 min，于波長536 nm處測吸光度（A），根據(jù)公式（1）計算茅莓莖總黃酮提取液對羥自由基（·OH）的清除率。茅莓根和葉分別按相同方法檢測。

羥自由基（·OH）清除率=[（A樣品-A樣參）-（A損傷-A空白）]/（A未損-A損傷）×100% （1）

1.2.3 茅莓莖總黃酮對超氧負(fù)離子（O2-）的清除作用[14] 采用鄰苯三酚自氧化法[15，16]。取Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.2） 4.5 mL分別與0.4 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，室溫下放置4 min，于325 nm處測定樣品吸光度（Ai）。取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL和3.0 mL 7 mmol/L鄰苯三酚，于325 nm處每隔30 s測其吸光度（A0），共記錄3 min。依上法，取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL分別與0.4 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，在室溫下放置4 min，立即加入3.0 mL 7 mmol/L鄰苯三酚并開始計時，以10 mmol/L HCl為參比，于325 nm處每隔30 s測定其吸光度（A），共記錄5 min。根據(jù)公式（2）計算茅莓莖總黃酮提取液對超氧負(fù)離子（O2-）的清除率。茅莓根和葉分別按相同方法檢測。

超氧負(fù)離子（O2-）清除率={1-[（A-Ai）/A0]}×100%

（2）

1.2.4 茅莓莖總黃酮對有機(jī)自由基（DPPH·）的清除作用 取2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液分別與2.0 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻。30 min后以樣品提取溶劑（30%乙醇溶液）為空白調(diào)零，于525 nm處測定其吸光度（Ai）；同時測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水混合液的吸光度（Ac）；取2.0 mL無水乙醇分別與2.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，于525 nm處測定其吸光度（Aj）。根據(jù)公式（3）計算茅莓莖總黃酮提取液對有機(jī)自由基（DPPH·）的抑制率。茅莓根和葉按相同方法檢測。

有機(jī)自由基（DPPH·）抑制率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

（3）

1.2.5 茅莓莖總黃酮對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA的作用[17] 處死大鼠，迅速取出其肝臟，用冷生理鹽水洗凈后擦干水分稱重，于冰水浴下用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿懸浮液。試驗組分別取不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液0.1 mL，置10 mL玻璃試管中，再分別加入0.1 mL 10%肝組織勻漿；對照組取0.1 mL 30%乙醇溶液與0.1 mL 10%肝組織勻漿，混合均勻封好試管口置于37 ℃恒溫水浴箱中溫育45 min。按MDA測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，分光光度計用蒸餾水調(diào)零后于532 nm處測各組的吸光度。根據(jù)公式（4）計算茅莓莖總黃酮提取液對MDA的抑制率。茅莓根和葉按相同方法檢測。

MDA的抑制率=（A對照組-A試驗組）/A對照組×100% （4）

2 結(jié)果與分析

2.1 茅莓莖總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用

由圖1可見，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對羥自由基的清除作用也隨之增強(qiáng)，茅莓莖黃酮濃度為100 μg/mL時，對羥自由基（·OH）的清除率為56.8%。

2.2 茅莓莖總黃酮對超氧負(fù)離子（O2-）的清除作用

由圖2可見，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對超氧負(fù)離子（O2-）的清除作用也隨之增強(qiáng)，茅莓莖總黃酮濃度為10 μg/mL時，對超氧負(fù)離子（O2-）的清除率為76.0%。

2.3 茅莓莖總黃酮對有機(jī)自由基（DPPH·）的清除作用

由圖3可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對有機(jī)自由基（DPPH·）的清除作用也隨之增強(qiáng)，茅莓莖總黃酮濃度為100 μg/mL時，對有機(jī)自由基（DPPH·）的清除率為92.0%。

2.4 茅莓莖總黃酮對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA的作用

由圖4可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的抑制作用也隨之增強(qiáng)，茅莓莖總黃酮濃度為100 μg/mL時，對MDA的抑制率為47.4%。

經(jīng)相同的方法分別對茅莓根和葉中總黃酮的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，與茅莓莖同體積的茅莓根和葉總黃酮濃度分別為6.0、25 μg/mL時，對超氧負(fù)離子（O2-）的清除率分別為46.1%、93.4%；茅莓根和葉總黃酮濃度分別為60、250 μg/mL時，對羥自由基（·OH）的清除率分別為41.6%、88.9%，對有機(jī)自由基（DPPH·）的清除率分別為71.0%、93.0%，對MDA的抑制率分別為46.0%、45.6%。

3 小結(jié)與討論

本試驗結(jié)果表明，茅莓根、莖、葉總黃酮均具有一定的抗氧化能力，且其黃酮類化合物的添加量在試驗范圍內(nèi)與其抗氧化性呈正相關(guān)。MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其生成的多少可以反映出組織細(xì)胞的受損程度。從試驗結(jié)果可得出，茅莓中總黃酮對脂質(zhì)過氧化有一定的抵抗能力，且與黃酮濃度呈量效關(guān)系。同體積的茅莓根、莖、葉黃酮提取液對羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子（O2-）、有機(jī)自由基（DPPH·）均具有清除能力，對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA均有一定的抑制作用。由于茅莓葉中黃酮含量相對較高，因此其體外抗氧化活性相對較高。茅莓根、莖、葉中的黃酮對超氧負(fù)離子（O2-）和有機(jī)自由基（DPPH·）的清除能力相對較強(qiáng)。自由基（Free radical，F(xiàn)R）是外層軌道上有不成對電子的原子、原子團(tuán)或分子的總稱，通常包括羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子自由基（O2-）、有機(jī)自由基（DPPH·）等。高濃度的自由基能夠破壞細(xì)胞成分，對機(jī)體十分危險，可使得糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等發(fā)生氧化，遭受損傷與破壞，從而引發(fā)衰老、腦缺血、帕金森氏癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、呼吸窘迫綜合征、心血管疾病和癌癥等疾病[18，19]。通過對羥自由基（·OH）、超氧負(fù)離子（O2-）和有機(jī)自由基（DPPH·）清除作用的研究發(fā)現(xiàn)，茅莓中黃酮對3種自由基均具有良好的清除作用，對3種自由基的清除作用均隨其濃度的增加而增強(qiáng)，呈明顯的量效關(guān)系，這種抗氧化能力來自于其酚羥基的供氫或供電子能力，從而與活性氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)。這一研究為進(jìn)一步開發(fā)利用茅莓資源提供了一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國植物志編輯委員會. 中國植物志（第三十七卷）[M].北京：科學(xué)出版社，1985.61.

[2] 任凌燕，李惠芝，邱宗蔭，等. 茅莓的生藥學(xué)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（1）：49-50.

[3] 都述虎，劉文英，饒金華，等. 制備型HPLC法分離2個茅莓皂苷單體成分[J].中草藥，2005，36（3）：348-350.

[4] 鄭振洨，黃常新，黃巧玲，等. 茅莓總皂苷抗腫瘤作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究[J].中華實驗外科學(xué)雜志，2005，24（5）：639.

[5] 汪 媛，賀玖明，陳 慧，等. 茅莓黃酮液相色譜-電噴霧質(zhì)譜與薄層色譜-表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J].分析化學(xué)，2006，34（8）：1073-1077.

[6] 譚明雄，王恒山，黎 霜，等.中藥茅莓化學(xué)成分的研究[J].廣西植物，2003，23（3）：282-284.

[7] 王先榮，杜安全，王紅萍. 中藥茅莓的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，1994，19（8）：486.

[8] 譚明雄，王恒山，黎 霜，等. 茅莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（1）：32.

[9] 蔡為榮. 微波提取荷葉黃酮及其清除羥基自由基的研究[J]. 食品科學(xué)，2004，25（9）：112-115.

[10] 謝貞建，焦士蓉，唐鵬程，等. 枳實總黃酮提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（7）：41-45.

[11] 張 鵬.銀杏葉黃酮的微波提取及其抗氧化性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（12）：5496-5497，5730.

[12] 劉德勝，鄭 紅，韓景田.茅莓總黃酮提取工藝的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（15）：3295-3297.

[13] 伍 鋼，彭密軍，彭 勝. 柑橘不同部位提取物對羥自由基的清除作用研究[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：41-43.

[14] 李明靜，慶偉霞，楊玉霞，等. 七種天然黃酮類化合物對超氧陰離子自由基的清除活性[J].化學(xué)研究，2006，17（4）：70-72.

[15] 張 娜，楊保求，王 倩，等.棗核黃酮類物質(zhì)的抗氧化性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：20037-20039.

[16] 韓少華，朱靖博，王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究[J].食品科技，2009，207（6）：155-157.

[17] 李 曉，馮 雷，胡尊麗，等.馬齒莧多糖的抗氧化活性研究[J].中國生化藥物雜志，2010，31（4）：244-246.

[18] 陳 穎，周 巖，曹銀萍，等.天花粉總皂苷的提取及其清除DPPH自由基作用的研究[J].藥物生物技術(shù)，2010，17（5）：397-399.

[19] 方允中，鄭榮梁.自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2008.1-25.