棉花抗黃萎病轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展

摘要：棉花（Gossypium hirsutum L.）黃萎病是棉花生長(zhǎng)過(guò)程中最具毀滅性的病害之一。國(guó)內(nèi)外研究者運(yùn)用各種育種手段培育出抗病品種，取得了一定的進(jìn)展，但仍無(wú)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的高抗黃萎病陸地棉品種。分析了抗病育種工作中存在的問(wèn)題，綜述了棉花抗黃萎病在轉(zhuǎn)基因育種方面的研究進(jìn)展，指出了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育棉花抗病品種是目前防治黃萎病最有效而可行的方法。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium hirsutum L.）；抗黃萎病；轉(zhuǎn)基因育種

中圖分類號(hào)：S562；S435.621 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）23-5673-03

棉花（Gossypium hirsutum L.）產(chǎn)業(yè)是我國(guó)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，為廣大棉農(nóng)每年帶來(lái)400億～600億元的直接經(jīng)濟(jì)收入，為城鎮(zhèn)提供近3 000萬(wàn)個(gè)就業(yè)崗位。棉花生產(chǎn)的發(fā)展關(guān)系到國(guó)計(jì)民生，地位舉足輕重。在阻礙我國(guó)棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的諸多因素中，棉花黃萎病的危害是其主要因素之一。

1 棉花黃萎病的危害

棉花黃萎病是世界毀滅性病害，病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia Kleb），自從傳入我國(guó)以來(lái)，危害逐年蔓延和加重。1993年黃萎病暴發(fā)成災(zāi)，全國(guó)棉花發(fā)病面積270萬(wàn)hm2，遍及各主要產(chǎn)棉區(qū)[1，2]；2003年棉花黃萎病流行面積達(dá)320萬(wàn)hm2，造成2.3億kg的皮棉產(chǎn)量損失[3]。據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的研究，7月下旬前發(fā)病平均減產(chǎn)高達(dá)66.9%，7月下旬后發(fā)病平均減產(chǎn)仍達(dá)20.3%。早期遭受落葉型和急性萎焉型黃萎病危害時(shí)，容易造成棉株死亡導(dǎo)致絕收。

2 棉花抗黃萎病轉(zhuǎn)基因育種的研究進(jìn)展

棉花黃萎病屬土傳維管束病害，病原菌寄主范圍廣，并存在明顯的致病力分化現(xiàn)象，防治困難。在綜合防治措施中，化學(xué)防治很難奏效并易造成環(huán)境污染；生物防治技術(shù)雖然表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但因生防因子?；蕴珡?qiáng)而制約了該技術(shù)的推廣應(yīng)用；對(duì)于重病田，不得不輪作倒茬，但仍不能徹底解決問(wèn)題。惟一經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的防治措施是使用抗病棉花新品種。在國(guó)家的高度重視和大力支持下，棉花生產(chǎn)用種的品種改良得到長(zhǎng)足發(fā)展，但從現(xiàn)有育成品種來(lái)看，仍不能滿足棉花生產(chǎn)的現(xiàn)實(shí)需求，兼?zhèn)湄S產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、廣適的棉花新品種極少，尤其是沒(méi)有兼抗棉花黃萎病的新品種。究其原因，主要是因?yàn)殛懙孛捱z傳基礎(chǔ)狹窄，種內(nèi)缺乏優(yōu)良的抗病資源。馬存等[4]曾對(duì)中國(guó)現(xiàn)存的近5 000份棉花品種資源進(jìn)行抗黃萎鑒定，高抗黃萎病的材料均為海島棉或野生棉，1 512份陸地棉資源中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫或高抗黃萎病的材料，抗黃萎病的也僅占0.8%。利用常規(guī)技術(shù)對(duì)陸地棉進(jìn)行抗病性遺傳改良時(shí)，存在周期長(zhǎng)、效率低、性狀間負(fù)向連鎖累贅難以克服等困難。所以僅僅依靠傳統(tǒng)育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)抗黃萎病等多個(gè)育種目標(biāo)聚合的難度較大。隨著植物抗病分子生物學(xué)的發(fā)展，利用各種抗病基因或誘發(fā)抗病基因以增強(qiáng)植物抗病性，在各種作物分子改良中得到廣泛應(yīng)用，抗病分子育種的條件已趨于成熟，為尋找棉花抗病基因、創(chuàng)制新的抗源材料開(kāi)辟了新途徑。

利用基因工程和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)針對(duì)棉花抗黃萎病正在進(jìn)行的研究方向有：①棉花抗黃萎病基因的定位和克隆。如Ve1基因首先從歐薄荷中克隆得到[5]，隨后在番茄[6]、陸地棉[7]中都進(jìn)行了功能驗(yàn)證，證明其對(duì)棉花黃萎病具有顯著抗性；最近在擬南芥中克隆得到的AHL19基因與棉花黃萎病的抗性存在很大關(guān)聯(lián)性[8]。②棉花分解脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）酶基因的克隆。棉花體內(nèi)酚類物質(zhì)主要可分為棉酚（Gossypol，G）、半棉酚（Hemigossypol，HG）、脫氧半棉酚（Desoxyl hemigossypol，dHG）等，已經(jīng)證實(shí)其中HG和dHG的含量受黃萎病菌（Verticillium dahliae Kleb）侵染誘導(dǎo)，并且對(duì)黃萎病菌有一定的毒性[9]。許多科學(xué)家希望能克隆此基因，然后利用反義基因技術(shù)，抑制該酶的含量，從而達(dá)到培育抗黃萎病棉花品種的目的。③分離黃萎病病原菌的毒素，克隆該毒素基因，進(jìn)一步分離棉花中的解毒酶。研究證明黃萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，這種糖蛋白毒素破壞了棉株的組織結(jié)構(gòu)，引起萎蔫甚至死亡[10]。④分離系統(tǒng)獲得性抗性（Systematic acquired resistance，SAR）中起關(guān)鍵作用的基因，利用誘導(dǎo)性抗性培育抗病品種。植物在病原菌“激發(fā)子”（Elicitor）的誘導(dǎo)下產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)（HR），一系列防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)也隨之變化，使得這種抗性水平逐漸擴(kuò)展到整株，形成對(duì)病原菌侵染的廣譜抗性[11]。

目前應(yīng)用的基因主要有幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶、植物防衛(wèi)素、硫素及葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GO）等外源抗病基因，并已獲得轉(zhuǎn)基因抗病棉花株系[12]。蔡應(yīng)繁等[13]利用基因槍法、葉盤法和花粉管通道途徑等基因工程技術(shù)將抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因?qū)朊藁?，?jīng)PCR檢驗(yàn)，得到陽(yáng)性結(jié)果。吳家和等[14]把幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶通過(guò)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入陸地棉品種冀合321和中棉所35基因組，獲得了轉(zhuǎn)基因棉花，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，7個(gè)轉(zhuǎn)化株均表現(xiàn)出不同程度的抗黃萎病或耐黃萎病特性。樂(lè)錦華等[15]將菜豆中的幾丁質(zhì)酶和煙草中的葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入棉花，并篩選出了高抗黃萎病的品系。齊俊生等[16]利用棉花黃萎病菌強(qiáng)致病力落葉型V991菌系的毒素誘導(dǎo)高抗黃萎病的海島棉品種，獲得一個(gè)抗黃萎病基因At7，并導(dǎo)入陸地棉，從而培育出高抗黃萎病的新株系。肖月華等[17]從棉花植株中分離克隆了多個(gè)具有抗病功能的基因，篩選出抗黃萎病的棉花品種。陳大軍等[18]將天麻抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入天然彩色棉主栽品種，選育出既抗枯萎病又抗黃萎病的兼抗材料。Murray等[19]將來(lái)自Talaromycesflavus的GO基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉株對(duì)根部大麗輪枝菌產(chǎn)生了一定的抗菌活性。劉慧君等[20]將GO基因轉(zhuǎn)入棉花，轉(zhuǎn)基因后代對(duì)枯萎病和黃萎病抗性均有顯著提高，部分材料抗性達(dá)到抗病水平。Degray等[21]通過(guò)研究抗菌肽MSI-99在葉綠體基因組中的表達(dá)獲得了能夠高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草植株。轉(zhuǎn)基因植株葉片提取物能夠抑制曲霉菌（Aspergillus sp.）、鐮刀菌（Fusarium sp.）、黃萎病菌等3種真菌孢子的生長(zhǎng)，抑菌效果高達(dá)95%。此外，Degray等[21]將D4E1基因序列在35S RNA啟動(dòng)子引導(dǎo)下通過(guò)農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)入煙草中，獲得了高抗黃萎病的植株，其葉片提取粗蛋白能夠抑制99%黃萎病菌的萌發(fā)。

溶菌酶是一類廣泛存在于自然界、對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌以及某些真菌或病毒具有殺滅作用的水解酶類。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所將蛋清溶菌酶HEWL基因和T4噬菌體溶菌酶基因利用畢赤酵母進(jìn)行重組表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)棉花枯萎病菌和黃萎病菌均具有明顯的抗性，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化陸地棉珂字312以及R15品系，獲得了轉(zhuǎn)基因種子，其ELISA、PCR檢測(cè)表達(dá)量較高的有多個(gè)株系，從初步篩選的陽(yáng)性植株中獲得多株高抗黃萎病菌的棉株，其中，繁殖后命名為DHGH-1和T4GH-1的棉株已進(jìn)入安全評(píng)價(jià)中間試驗(yàn)。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種有益的土壤細(xì)菌，具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)、很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性，能分泌多種抗菌物質(zhì)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所從枯草芽孢桿菌菌株B111中提取得到抗菌蛋白BS2，其對(duì)棉花黃萎病菌、枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、水稻條斑病菌（Bacterial leaf streak）、白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）等病原菌均具有抗性，尤其對(duì)棉花落葉型黃萎病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)畢赤酵母無(wú)影響。將該蛋白酶基因?qū)虢湍钢蝎@得有效表達(dá)，重組蛋白同時(shí)具有蛋白酶活性和抗菌活性。同時(shí)，利用枯草芽孢桿菌的內(nèi)生性特性將該菌株定殖在棉株中，能有效促進(jìn)棉株發(fā)育，提高棉株的抗病性和棉花產(chǎn)量。

在棉花轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)方面，主要有花粉管通道法、基因槍轟擊法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法3種方法。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化因再生體系比較成熟，能轉(zhuǎn)移人工分離和修飾過(guò)的外源基因，成功率高，外植體的適用范圍廣，轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝或雙拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，是棉花上應(yīng)用最廣泛的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[22]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花所用的選擇標(biāo)記基因有nptII、hpt、Bar基因等；轉(zhuǎn)化的目的基因包括抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗病、抗逆、雄性不育、提高油酸含量和纖維品質(zhì)改良等基因；外植體包括子葉、下胚軸、子葉節(jié)、葉柄、莖尖和胚性愈傷組織等。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院還建立了棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系平臺(tái)，通過(guò)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、花粉管通道法的有效整合，達(dá)到了每年轉(zhuǎn)化8 000株的規(guī)模。

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)將抗黃萎病基因轉(zhuǎn)移到陸地棉中，創(chuàng)造抗性強(qiáng)的棉花新材料，可望從根本上解決陸地棉黃萎病抗原嚴(yán)重缺乏的問(wèn)題，也必將為棉花抗黃萎病育種開(kāi)拓廣闊的前景。

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