兔戊型肝炎病毒ORF2編碼蛋白的抗原表位分析

王松，戴星，董晨，董敏，梁久紅，孟繼鴻

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚科，江蘇南京 210009)

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一種經(jīng)糞-口途徑傳播的病毒性肝炎，呈全球分布。根據(jù)全基因組序列分析，HEV可分為4個基因型［1］:1型以緬甸株為代表，2型以墨西哥株為代表，3型以美國株為代表，4型以中國株為代表;其中1型和2型只感染人，3型和4型既感染人又感染動物。自1997年第一株動物 HEV［2］——豬 HEV美國株分離以來，已在多種動物包括非人靈長類動物、嚙齒類動物、家豬、野豬、鹿、雞、馬、牛、羊、狗、貓等體內(nèi)檢出 HEV 抗體［3］，并在家豬、野豬、鹿、兔和雞等動物體內(nèi)檢測到HEV RNA，提示HEV不僅在人類中流行，而且也存在動物宿主，可由動物傳染給人［4］。動物HEV傳染人的最直接證據(jù)來自日本，在HE患者與食物剩余的野豬肉和鹿肉中檢出同一HEV［5］。這些研究結(jié)果使人們認識到HE是一種人畜共患病。

近年，我國研究人員首先在農(nóng)場養(yǎng)殖兔體內(nèi)分離出HEV［6］，基因序列分析顯示兔HEV與已知1-4基因型HEV差異較大并可能構(gòu)成一個新的基因型。此外，兔HEV抗體能被人源HEV抗原檢測出來，提示兔HEV可能與已知基因型HEV含有共同的抗原表位。本實驗室最近在江蘇散養(yǎng)家兔的膽汁標本中成功分離出兔 HEV［7］。本研究選取一株兔 HEV毒株 JS120(GenBank序列號:JQ065059)，通過制備兔HEV ORF2蛋白C端片段p166(aa452-617，R166)及抗-R166的McAbs，進一步研究兔HEV與已知基因型HEV抗原表位的異同，為闡明兔HEV的人畜共患特征及戊型肝炎的診斷和預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 抗原的制備

將HEV緬甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美國株(AF035437)、中國株(AJ272108)和兔HEV毒株JS120(JQ065059)編碼 ORF2 p166(aa452-617)基因片段，插入PET28a載體(Pharmacia產(chǎn)品)構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株(Promega產(chǎn)品)，表達6His-ORF2融合蛋白p166，經(jīng)鎳柱(Pharmacia產(chǎn)品)純化的融合蛋白分別命名為 p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn 和 R166。

1.2 抗R166單克隆抗體的制備

1.2.1 動物免疫和細胞融合 采用常規(guī)方法以R166免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，共3次，每次免疫間隔2周。末次免疫后3 d，取免疫的小鼠脾細胞，在PEG4000的作用下與SP2/0骨髓瘤細胞以10∶1的比例融合，加入已制備有飼養(yǎng)細胞的96孔板，以含20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)液置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中選擇培養(yǎng)。

1.2.2 雜交瘤細胞株的建立 用所免疫的R166重組蛋白包被酶標反應(yīng)板，采用間接ELISA法檢測細胞培養(yǎng)板孔上清液，TMB底物顯色，測定A450nm吸光度值，P/N＞2.1判定為陽性。雜交瘤細胞篩選時，R166檢測陽性，同時無關(guān)抗原His-HCV NS3重組蛋白檢測陰性為預(yù)期McAb陽性孔。陽性孔細胞經(jīng)2～3次有限稀釋法進行亞克隆，至100%培養(yǎng)孔陽性，建立分泌McAb的雜交瘤細胞株，并將克隆化的細胞擴大培養(yǎng)并制備腹水，離心取上清，置-20℃保存。

1.2.3 McAb的類和亞類的鑒定及效價測定 采用上述間接ELISA法以HRP標記的兔抗鼠IgG亞類抗體(KPL產(chǎn)品)及兔抗鼠IgM抗體為二抗(KPL產(chǎn)品)鑒定McAbs的Ig類別;收集小鼠腹水并進行10倍系列稀釋，采用間接ELISA法檢測抗體效價。

1.3 HEV重組蛋白抗原表位分析

1.3.1 計算機輔助的序列分析 從GenBank中提取HEV緬甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美國株(AF035437)、中國株(AJ272108)的基因組序列，同時本實驗室自行分離鑒定兔HEV并測序，使用LASERGENE計算機軟件系統(tǒng)(DNASTAR，Inc.美國 Wisconsin)的MegAlign Program進行計算機輔助序列分析。

1.3.2 ELISA檢測 用已知基因1-4型HEV和兔HEV ORF2 p166重組蛋白分別包被酶標反應(yīng)板，加入不同雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清，37℃孵育45 min，洗滌6次，HRP標記的羊抗鼠IgG抗體作為酶標二抗，37℃孵育45 min，洗滌6次，以TMB為底物顯色，測定A450nm值，P/N＞2.1判定為陽性。

1.3.3 免疫印跡法(Western blotting)檢測 將基因1-4型HEV及兔HEV的p166純化蛋白，經(jīng) SDSPAGE后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜進行免疫印跡反應(yīng)，以含5%脫脂牛奶TBST封閉2 h，洗滌3次后分別加入不同雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，室溫搖動2 h，洗膜3次，加入1∶2 000 HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，室溫搖動2 h，洗膜3次，加入DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蒸餾水終止顯色，攝像保存。

1.4 McAbs中和活性的鑒定

采用前期建立的基于PCR的HEV體外中和試驗［8］，將制備所得的McAbs腹水分別與100倍的HEV最低感染滴度的基因1型、4型HEV及兔HEV混合，37℃孵育1 h后接種單層PLC/PRF/5細胞，37℃孵育2 h，洗滌3次，按常規(guī)方法抽提HEV RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-套式聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-nPCR)檢測HEV RNA，以PCR結(jié)果陰性判為中和試驗陽性。

2 結(jié) 果

2.1 融合及篩選

獲得3株穩(wěn)定分泌抗R166 McAbs的雜交瘤細胞株，即1C1、6F9和10D2。以 R166 檢測陽性，His-HCV NS3重組蛋白檢測陰性，說明所制備的McAbs是針對R166中HEV基因編碼蛋白的特異性抗體。

2.2 McAb的類和亞類的鑒定及效價測定

將3株雜交瘤細胞直立培養(yǎng)2周后收集上清，同時也制備腹水，經(jīng) ELISA鑒定，1C1、6F9和10D2類和亞類鑒定均為IgG1，6F9和10D2腹水的抗體滴度均為1∶10-5，1C1腹水的抗體滴度為 1∶10-4。

2.3 HEV重組蛋白抗原表位的分析

2.3.1 HEV 1-4基因型及兔HEV p166重組蛋白序列分析 比較已知HEV1-4基因型代表株緬甸株、墨西哥株、美國株和中國株及兔HEV JS120株編碼p166蛋白的核苷酸序列，同源性為74.2%～80.9%，但在氨基酸水平，同源性高達88.0%～94.0%，提示不同基因型的p166重組蛋白在氨基酸水平具備相當?shù)谋Ｊ匦?，有可能存在共同的抗原表位。從氨基酸位點的差異來看(如圖 1 所示)，與 p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn相比，R166有5個氨基酸殘基的改變，分別位于81、125、130、155和163位點，提示兔 HEV 有可能存在與已知基因型HEV不同的抗原表位。

2.3.2 ELISA分析 采用已知4個基因型HEV的p166 重組蛋白(p166Bur、p166Mex、p166Us和 p166Chn)和兔HEV的p166重組蛋白(R166)作為包被抗原進行ELISA檢測。3株雜交瘤細胞株中，1C1和6F9與5種p166均反應(yīng);10D2只與R166反應(yīng)，而不與p166Bur、p166Mex、p166Us和 p166Chn反應(yīng)。提示 R166與已知4個基因型HEV重組蛋白p166含有共同的抗原表位，也存在R166特有的抗原表位。

2.3.3 Western blotting分析 根據(jù)本研究中p166重組蛋白的氨基酸殘基數(shù)目，p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn和R166等5種重組蛋白的分子質(zhì)量約為24 kDa，其SDS-PAGE可見預(yù)期條帶(圖2)。將3株雜交瘤細胞分泌的McAbs分別進行western blot檢測，1C1株和6F9株在5種重組蛋白泳道均出現(xiàn)特異性24 kDa棕色反應(yīng)條帶，10D2株僅在R166泳道出現(xiàn)特異性24 kDa棕色反應(yīng)條帶，在其他泳道均無特異條帶出現(xiàn)(圖3)。3株McAbs的Western blotting檢測結(jié)果與上述ELISA檢測結(jié)果完全一致，再次提示R166與已知1-4基因型HEV含有共同的和不同的抗原表位。

2.4 McAb中和活性的鑒定

基于PCR的HEV體外中和試驗檢測顯示，3株McAbs均不能阻斷基因1、4型人HEV及兔HEV對培養(yǎng)細胞的感染性，不具有中和活性，提示這3株McAbs結(jié)合的抗原表位是非中和性表位。

3 討 論

由于缺乏成熟的HEV細胞培養(yǎng)模型，目前HEV診斷主要依靠基因工程表達的重組蛋白或合成肽作為HEV特異性抗體檢測的包被抗原。HEV ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白由660個氨基酸組成，其C端的2/3部分含有多個具有免疫優(yōu)勢的B細胞表位，廣泛應(yīng)用于HEV感染的免疫診斷及疫苗研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HEV ORF2 C端基因編碼的一段含有166個氨基酸殘基的重組蛋白(aa452-617)，含有HEV構(gòu)型依賴性中和抗原表位，用緬甸株p166Bur(1型)免疫血清能夠交叉中和3種不同基因型的HEV毒株(1型巴基斯坦株、2型墨西哥株、3型美國株)，提示不同基因型p166含有共同的中和抗原表位［9］。而后我們在抗原表位的分析研究中，分別制備出來源于第1、2、3和4基因型重組蛋白p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn的McAb，發(fā)現(xiàn)4種基因型存在共同的抗原表位和基因型特異性的抗原表位［10-13］。另外，有研究提示某些感染3、4型HEV的病人對1、2型重組抗原制備的免疫診斷試劑缺乏IgG或IgM反應(yīng)性［14-15］;我們也發(fā)現(xiàn)不同基因型和亞型的HEV重組蛋白p166對不同血清標本HEV抗體檢測的敏感性高低不同［16-17］。

圖1 HEV 1(Bur)、2(Mex)、3(Us)、4(Chn)基因型及兔HEV代表株 ORF2 p166重組蛋白的氨基酸序列比較Fig 1 Amino acid comparison of ORF2 p166 combinant proteins encoded by genotype 1(Bur)，2(Mex)，3(Us)，4(Chn)and rabbit HEV

圖2 5種不同基因型p166重組蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig 2 SDS-PAGE analysis of five different genotypes HEV p166 recombinant proteins

近年來，我國學(xué)者首先在兔體內(nèi)分離出一種新的HEV［6］，可能構(gòu)成HEV的新基因型。本實驗室也在江蘇家兔體內(nèi)分離出兔HEV，其抗原表位特點有待闡明。我們選取一株兔HEV-JS120制備p166重組蛋白，免疫動物并制備McAbs，分析兔HEV與已知基因型HEV抗原表位的異同。本研究共得到3株能穩(wěn)定分泌兔HEV p166相關(guān)的雜交瘤細胞株，ELISA及Western blotting檢測結(jié)果提示，1C1株和6F9株是兔HEV與已知4種基因型HEV的共同型McAb，而10D2是兔HEV的特異性McAb，表明兔HEV與已知4種基因型HEV既含有共同的又含有不同的抗原表位。對5種p166氨基酸序列進行分析，R166有5個氨基酸殘基的改變，分別位于81、125、130、155和163位點。10D2只與R166反應(yīng)，而不與其他4種p166反應(yīng)，提示上述5個位點中的一個或多個氨基酸殘基的改變可能是引起R166抗原表位變異的原因，這種現(xiàn)象在已知HEV其他基因型和其他病毒中也有報道［10］。利用基于PCR的HEV體外中和試驗，本研究所獲得的3株McAbs均不能中和兔HEV及基因1、4型HEV，提示3株McAbs針對的抗原表位是非中和性抗原表位。

圖3 McAb(1C1、6F9和10D2)與5種不同基因型p166重組蛋白的免疫印跡反應(yīng)Fig 3 Wester blotting analysis of McAb(lc1，bFa and 10D2)reacted with five different genotypes HEV p166 recombinant proteins

綜上所述，兔HEV作為一種新發(fā)現(xiàn)的HEV，其編碼重組蛋白R166與已知1-4基因型HEV ORF2 p166含有共同的和不同的抗原表位，這些異同有助于深入研究不同基因型HEV抗原表位的變異，更加深入認識兔HEV的生物學(xué)特性，對擴展HEV的動物宿主的認識和防治具有重要價值。

［1］LU L，LI C H，HAGEDORN C H.Phylogenetic analysis of global hepatitis E virus sequences:genetic diversity，subtypes and zoonosis［J］.Rev Med Virol，2006，16(1):5-36.

［2］MENG X J，PURCELL R H，HALBUR P G，et al.A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus［J］.Proc Natl Acad Sci，1997，94(18):9860-9865.

［3］ZHANG W，SHEN Q，MOU J，et al.Hepatitis E virus infection among domestic animals in eastern China［J］.Zoonoses Public Health，2008，55(6):291-298.

［4］MENG X J.Recent advances in hepatitis E virus［J］.J Viral Hepat，2010，17(3):153-161.

［5］DALTON H R，BENDALL R，IJAZ S，et al.Hepatitis E:an emerging infection in developed countries［J］.Lancet Infect Dis，2008，8(11):698-709.

［6］ZHAO C，MA Z，HARRISON T J，et al.A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China［J］.J Med Virol，2009，81(8):1371-1379.

［7］WANG S，DONG C，DAI X，et al.Hepatitis E virus(HEV)isolated from rabbits is highly genetic heterogeneity but with very similar antigenicity to human HEV［J］.J Med Virol，2013，85(4):627-635.

［8］MENG J H，DUBREUIL P，PILLOT J.A new PCR-based semneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E［J］.J Clin Microbiol，1997，35:1373-1377.

［9］MENG J H，DAI X，CHANG J C，et al.Identification and characterization of the neutralization epitope(s)of the hepatitis E virus［J］.Virology，2001，288(2):203-211.

［10］梁久紅，孟繼鴻，趙宇，等.不同基因型戊型肝炎病毒的抗原表位分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2003，23(10):817-821.

［11］趙宇，梁久紅，孟繼鴻，等.戊型肝炎病毒 I、Ⅱ與 III、Ⅳ基因型B細胞抗原表位的異同［J］.中國免疫學(xué)雜志，2004，20(9):591-595.

［12］鄧蕾，孟繼鴻，趙宇，等.不同基因型戊型肝炎病毒存在多種類型抗原表位［J］.微生物學(xué)報，2006，46(1):120-126.

［13］汪源，梁久紅，董晨，等.戊型肝炎病毒第Ⅳ基因型特異性抗原表位的鑒定與定位［J］.微生物與感染，2006，1(3):149-152.

［14］KWO P Y，SCHLAUDER G G，CARPENTER H A，et al.A-cute hepatitis E by a new isolate acquired in the United States［J］.Mayo Clin Proc，1997，72(12):1133-1136.

［15］WANG Y C，LING R，ERKER J C，et al.A divergent genotype of hepatitis E virus in Chinese patients with acute hepatitis［J］.J Gen Virol，1999，80(Pt 1):169-177.

［16］盧晶，戴星，孟繼鴻.不同基因型戊型肝炎病毒重組抗原p166用于抗體檢測的價值［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2006，26(4):369-374.

［17］孟繼鴻，戴星，竇曉光，等.不同基因型戊型肝炎病毒重組蛋白的抗原性分析［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2002，21(1):31-35.