柱后光化學衍生高效液相色譜法同時測定牛奶中黃曲霉毒素

王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，是一種常見的腐生真菌，多見于發(fā)霉的糧食、糧食制品及其它霉腐的有機物上，其主要存在形式為B1，B2，G1，G2。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為常見，其毒性和致癌性最強。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為一級致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)［1］。研究表明，長期食用被黃曲霉毒素污染的食物將導致肝癌、胃癌、腸癌等疾病，為了防止黃曲霉毒素危害人類健康，世界各國對黃曲霉毒素在食品中的殘留限量做了嚴格的規(guī)定［2］。

黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法［3-5］。劉曉茂等［6］采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用植物油中的黃曲霉毒素，該方法具有靈敏度高、選擇性強和定量結(jié)果準確等優(yōu)點，但儀器較為昂貴，使用成本高，很難普及應用，且凈化過程繁瑣，需要消耗大量有機溶劑。筆者采用Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱處理樣品，應用光化學衍生，結(jié)合高效液相色譜法同時測定牛奶中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2。該法具有操作簡單、速度快、消耗溶劑少等優(yōu)點，為實驗室開展黃曲霉毒素的檢測提供參考方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters e2695型，主要包括2475熒光檢測器、柱溫箱、自動進樣器、自動脫氣四元梯度泵等，美國Waters公司；

光化學衍生器：HM11104型，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；

氮氣吹干儀：HP-5016型，上海洛成分析儀器有限公司；

漩渦混勻器：IKA MS3 basic型，德國IKA公司；

離心機：TDZ5-WS型，長沙湘智離心機儀器有限公司；

超生波清洗機：SB-800DT型，寧波新芝生物科技有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司；

多功能凈化柱（MFC）：Mycosep 228 Afl aPat，美國Romer Labs公司；

甲醇、乙腈：色譜純；

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準品：2.0 μg／mL，美國Sigma公司；

實驗用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得。

1.2 儀器分析條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動 相：甲 醇-乙 腈-水（體 積 比 為25∶20∶55），流速為1.0 mL／min；進樣體積：20 μL；柱溫：30℃；熒光檢測器：激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長430 nm。

1.3 樣品預處理

準確稱取5 g（精確到0.01 g）試樣至50 mL具塞離心管中，加入25 mL乙腈-水混合溶液（體積比為80∶20），漩渦混勻后超聲提取30 min，以4 000 r／min離心10 min，吸取10 mL上清液至多功能凈化柱的玻璃試管中，將裝有填料的多功能凈化柱插入玻璃試管，并緩慢推動多功能凈化柱至玻璃試管的底部，上清液通過多功能凈化柱中的填料并與填料充分接觸，移取1 mL通過多功能凈化柱的凈化液于另一玻璃試管中，60℃加熱,氮氣吹干，再加入1 mL流動相溶解混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法

多功能凈化柱（MFC）是一種特殊的固相萃取柱，其填料中含有親脂性（非極性）和電荷活性（極性）成分，可選擇性吸附樣品提取液中的脂類、蛋白質(zhì)類化合物和碳水化合物等干擾物質(zhì)，而讓待測化合物通過凈化柱，從而達到分離純化的目的［7］。多功能凈化柱操作簡便，不需要進行活化、淋洗和洗脫等操作，縮短了樣品的前處理時間。筆者選用美國Romer Labs公司的Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱，對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進行分離純化，取得了十分理想的效果。

2.2 提取方法

樣品的提取方法主要根據(jù)其物理化學性質(zhì)來確定。黃曲霉毒素易溶于極性溶劑而不溶于非極性溶劑，且在中性溶液中較穩(wěn)定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或幾種有機溶劑的混合液對黃曲霉毒素進行提取。黃曲霉毒素雖然難溶于水，但是提取液中少量的水可以潤濕基質(zhì)，增強有機溶劑在樣品中的滲透能力，因此采用有機溶劑與水的混合溶液作為提取劑，可以提高樣品的提取效率。分別以乙腈-水體積比為20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0為提取劑對牛奶中黃曲霉毒素進行提取，結(jié)果表明，以乙腈-水體積比為80∶20時的提取效率最高，回收率在85%以上。

2.3 衍生方法

高效液相色譜法已經(jīng)成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法，但是黃曲霉B1和G1的熒光強度較弱，且黃曲霉毒素B1在水溶液中會發(fā)生熒光淬滅，因此需要采用衍生的方法增強B1和G1的熒光強度。常用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生［8］、柱后碘衍生［9］等，但衍生過程復雜、檢測靈敏度及重現(xiàn)性受人為因素影響較大。本實驗利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性，采用光化學衍生技術(shù)，以流動相中的水作為衍生劑，對黃曲霉毒素進行衍生化處理，使流動相中的水與黃曲霉毒素B1作用，生成熒光特性更強、更穩(wěn)定的化合物，從而解決了黃曲霉毒素B1在水溶液中發(fā)生熒光淬滅的問題，而且增加了黃曲霉毒素的熒光強度［10］。

2.4 線性范圍和檢出限

分別稱取適量黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準品溶于甲醇，配成質(zhì)量濃度為60 ng／mL的標準儲備液。吸取適量體積黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的標準儲備溶液，用流動相稀釋配成相應濃度的混合標準溶液，并按選定的色譜條件進行分析。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)量濃度與其峰面積具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)在0.999 4～0.999 9之間，相應的線性回歸方程見表1。在空白牛奶樣品中加入標準品，按上述方法處理樣品，根據(jù)3倍信噪比（S／N）峰的響應值計算，得到黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.50，0.10，0.50，0.10 μg／kg。牛奶加標樣品的色譜圖見圖1。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程和方法檢出限

圖1 牛奶加標樣品的色譜圖

2.5 回收試驗與精密度試驗

在牛奶空白樣品中加入3組不同濃度水平的黃曲霉毒素標準溶液，按實驗方法進行樣品處理和測定，考察實驗方法的回收率，并對加標樣品重復測定6次，考察實驗方法的精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的回收率為85.6%～92.0%，測定結(jié)果的相對標準偏差（RSD）為1.72%～3.52%。

3 結(jié)語

建立了一種以高效液相色譜-熒光檢測器同時檢測牛奶中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。采用Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱對牛奶樣品中的黃曲霉毒素進行分離純化，并用柱后光化學衍生技術(shù)增加黃曲霉毒素的熒光強度。該方法具有簡便、快速、準確、靈敏度高等優(yōu)點，為牛奶中黃曲霉毒素的檢測提供了實用的技術(shù)手段。

表2 牛奶樣品中黃曲霉毒素加標回收率和精密度試驗結(jié)果

［1］柳潔，何碧英.黃曲霉毒素高效液相色譜檢測方法研究進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15(7): 891-896.

［2］王新麗，張玉黔. HPLC柱后衍生同時測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的探討［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(2): 225-226.

［3］竇玉平.薄層層析法測定糧食中的黃曲霉毒素B1［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2011(1): 23.

［4］廖妍儼，黃家?guī)X.酶聯(lián)免疫法檢測牛奶中黃曲霉毒素M1的應用［J］. 貴州化工，2012，37(4): 33-39.

［5］于成廣，黃輝. UPLC-MS-MS 法快速測定玉米中的黃曲霉毒素B1［J］.化學分析計量，2012，21(2): 81-83.

［6］劉曉茂，李學民，王飛，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用植物油中4種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2012，3(5): 513-518.

［7］朱孟麗.用Mycosep TM凈化柱和高效液相色譜法對谷物中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定［J］.飼料工業(yè)，2006，27(3): 36-38.

［8］SN0339-1995 出口茶葉中黃曲霉毒素B1的檢驗方法［S］.

［9］GB／T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法［S］.

［10］李軍，于一茫，田苗，等.免疫親和柱凈化-柱后光化學衍生-高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色譜，2006，24(6): 581-584.