草莓炭疽病分生孢子離體快速繁殖技術(shù)探討

忻 雅，馬華升，阮松林，王淑珍，方獻(xiàn)平，肖文斐

(浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

草莓屬于薔薇科草莓屬，被譽(yù)為水果皇后，國外稱之為廉價的保健產(chǎn)品。中國目前草莓生產(chǎn)面積約7萬 hm2，居世界第1位，主要產(chǎn)地分布在安徽、遼寧、河北、山東、江蘇、上海、浙江等東部沿海地區(qū)，設(shè)施栽培草莓更是成為各地高效特色主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。目前南方主栽的紅頰和章姬等品種主要來自日本，不僅商品性好，口感更適合亞洲人，但其易感炭疽病的特性限制了設(shè)施草莓的可持續(xù)發(fā)展［1］。

草莓炭疽病主要爆發(fā)在夏季草莓育苗后期和初秋定植初期，主要為害匍匐莖與葉片。草莓炭疽病是由半知菌類黑盤孢目黑盤孢科刺盤孢菌屬(Colletotrichum spp．)真菌引起［2］，已經(jīng)明確的致病菌主要有 3種，分別為 C．gloeosporioides、C．a(chǎn)cutatum 和 C．fragariae［3］，我國草莓生產(chǎn)上以膠孢炭疽菌 (C．gloeosporioides)為多見。

目前國內(nèi)對草莓炭疽病的研究主要集中在病原菌的鑒定［4-5］和防治藥劑篩選［6-8］，對于發(fā)病規(guī)律、流行條件、測報方法等報道很少。病害防治缺乏理論依據(jù)，達(dá)不到理想效果，病害逐年加重。全面、深入地了解該菌的生物學(xué)特性有助于制定和完善草莓炭疽病的防治措施。本研究通過在人工控溫、控濕條件下，研究炭疽病菌在人工條件下的產(chǎn)孢條件，以期明確病菌繁殖的發(fā)生規(guī)律，為病害的田間防控提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 草莓炭疽病病菌分離部位和抗生素篩選

供試草莓品種為紅頰。2011年7月，從建德、臨安等草莓育苗基地采集帶有炭疽病斑的植株，分別以有病斑的葉片、匍匐莖和根冠為材料，在病健交界處取樣。葉片樣品剪取5 mm ×5 mm左右的小塊，匍匐莖切成5 mm長、2～3 mm厚的小塊，根冠部剖開后取開始褐變的組織切成5 mm見方、2～3 mm厚的小塊。設(shè)置不同的抗生素處理:①氨芐青霉素 50 μg·mL-1+ 鏈霉素 50 μg·mL-1，②鏈霉素50 μg·mL-1，③不加抗生素。樣品用0.1%升汞進(jìn)行表面滅菌，處理3 min后用滅菌水洗3次，置于光照培養(yǎng)箱 (MMM，德國)25℃、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)。分離部位和抗生素處理形成9種組合，每種組合各接20皿，接種7 d后觀察雜菌污染率。

1.2 濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

用上一步分離出的炭疽病菌邊緣菌絲塊 (3 mm×3 mm)為材料，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，加入氨芐青霉素 50 μg·mL-1和鏈霉素 50 μg·mL-1。根據(jù)小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法，進(jìn)行適當(dāng)改良，形成濕度分別為100%，90%，80%和70%的環(huán)境。光照培養(yǎng)箱內(nèi)25℃培養(yǎng)，光照為1 050 lx。5 d后觀察菌落大小，10 d后用血球計數(shù)器統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。

1.3 濕度和光照組合對草莓炭疽病分生孢子的影響

用上一步篩選出來的2個適宜濕度，結(jié)合不同光照處理 (Hobo電子照度溫度儀)，形成8個組合，10 d后觀察每皿分生孢子數(shù)量。

1.4 培養(yǎng)基和接種形態(tài)對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

選用3種培養(yǎng)基:PDA、PSA、酵母膏培養(yǎng)基;2種接種形態(tài):生長旺盛的菌落邊緣菌絲塊 (打孔器取直徑8 mm的圓塊)、適量分生孢子團(tuán)涂開成直徑8 mm的圓。組合成6種處理，在人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為25℃，濕度80%，光照為252 lx。7 d后觀察菌落大小，并刮去菌絲，10 d后統(tǒng)計每皿分生孢子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株部位和抗生素對草莓炭疽病菌分離效果的影響

表1所示，與不加抗生素相比，加抗生素①(氨芐青霉素 50 μg·mL-1+ 鏈霉素 50 μg·mL-1)后，污染率分別下降23.1%，54.5%和27.3%，加抗生素②(鏈霉素50 μg·mL-1)后，污染率分別下降7.7%，36.4%和9.1%。不同分離部位相比，匍匐莖在不同抗生素處理中的污染率都為最低。因此，加抗生素①、以匍匐莖為接種材料，能盡量減少草莓炭疽病菌分離時的污染率。

表1 不同分離部位和抗生素濃度下的污染率

2.2 濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子生長的影響

用改良后的小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法研究濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子生長的影響，結(jié)果如表2所示，菌落直徑隨著濕度成比例增加，差異不顯著。濕度為80%時孢子量最大，70%時其次，都顯著高于另外2個濕度，100%的濕度產(chǎn)孢量最少。

表2 不同濕度炭疽病菌絲及分生孢子的生長情況

2.3 濕度和光照組合對草莓炭疽病分生孢子的影響

圖1顯示，除了全黑暗培養(yǎng)，其他光照強(qiáng)度下產(chǎn)孢量都是80%濕度高于70%，這與上面小容器空氣濕度調(diào)節(jié)法研究結(jié)果一致。其中，光照為252 lx時2種濕度下分生孢子的數(shù)量都顯著高于其他處理，其他處理間差異不顯著。

圖1 濕度和光照組合處理對草莓炭疽病分生孢子的影響

2.4 培養(yǎng)基及接種形態(tài)對草莓炭疽病菌絲及分生

孢子的影響

如圖2所示，從菌落直徑看，接種菌絲比接種孢子效果略好。但從分生孢子數(shù)量看，接種孢子顯著高于接種菌絲，其中PDA和PSA培養(yǎng)基沒有顯著差異。酵母培養(yǎng)基不適合用于膠孢炭疽菌的分生孢子培養(yǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)基及接種形態(tài)對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

3 小結(jié)與討論

從本研究結(jié)果看，以匍匐莖為接種材料，培養(yǎng)基中加氨芐青霉素 50 μg·mL-1和鏈霉素 50 μg·mL-1，能顯著減少草莓炭疽病菌分離時的污染率。以PDA或PSA為培養(yǎng)基，以孢子堆為接種材料，光照為252 lx，濕度為80%，是分生孢子產(chǎn)生的最佳條件。

草莓根冠部直接與土壤接觸、葉片又相對容易感染其他病害，因此，病害癥狀明顯且細(xì)菌感染較少的匍匐莖是分離草莓炭疽病的較好部位。80%的濕度是產(chǎn)生分生孢子的最佳條件，這也是育苗后期高溫高濕條件下，炭疽病容易造成大面積死苗的原因。因此，控制子苗繁殖系數(shù)、挖除老苗，剝除老葉、殘葉等農(nóng)藝措施［9］，可以盡量降低環(huán)境濕度，減少炭疽病的發(fā)生。PDA和PSA培養(yǎng)基對草莓炭疽病分生孢子的生長沒有顯著差異，與張海英等［4］的研究結(jié)果有較大差異。弱光培養(yǎng)下可以產(chǎn)生最大量的孢子，與張海英等［4］的研究結(jié)果較為一致，但與姚紅燕等［10］的結(jié)果略有不同。

［1］ 俞庚戍，丁峙峰，張成義，等.“紅頰”草莓苗期炭疽病藥劑防治研究 ［J］.中國南方果樹，2009，38(4):83-85.

［2］ 魏景超.真菌鑒定手冊 ［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979:463-475.

［3］ Porta-Puglia A，Mifsud D. Firstrecord ofColletotrichum acutatum on s trawberry in Malta ［J］. Journal of Plant Pathology，2006，88(2):228.

［4］ 張海英，張明會，劉志恒，等.草莓炭疽病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究 ［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38(3):317-321.

［5］ 任小杰，梁艷，陸金萍，等.上海地區(qū)草莓炭疽病病原鑒定 ［J］.植物病理學(xué)報，2008，38(3):325-328.

［6］ 俞庚戍，丁峙峰，張成義，等.草莓紅頰育苗期應(yīng)用多效唑防控炭疽病試驗 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(5):1029-1030.

［7］ 張雪，張志宏，劉月學(xué)，等.木霉菌劑提高‘紅顏’草莓炭疽病抗性的效應(yīng) ［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19(8):153-156.

［8］ 霍恒志，糜林，李金鳳，等.設(shè)施避雨育苗對紅頰草莓炭疽病的防治效果 ［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21(9):93-94.

［9］ 楊肖芳，蔣桂華，鄒宜靜.草莓炭疽病防控育苗技術(shù)［J］.上海蔬菜，2010(3):74-75.

［10］ 姚紅燕，王揚(yáng)軍，周金波，等.寧波地區(qū)草莓炭疽病的病原鑒定和生物學(xué)特性 ［J］.寧波農(nóng)業(yè)科技，2010(2):5-8.