芽孢桿菌活體微生物農(nóng)藥研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

王 春，汪 琨，崔志峰

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310014)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年都會(huì)因病蟲害而造成巨大損失。長(zhǎng)期以來(lái)人們一直主要采用化學(xué)農(nóng)藥控制農(nóng)作物病蟲害，但化學(xué)農(nóng)藥的3R問題 (殘留、再增猖獗、抗性)已引起越來(lái)越多的關(guān)注。目前在生物農(nóng)藥中，微生物活體農(nóng)藥已占有舉足輕重的地位，特別是現(xiàn)代微生物技術(shù)等新的研究開發(fā)手段應(yīng)用于微生物農(nóng)藥領(lǐng)域，大大促進(jìn)了活體微生物農(nóng)藥的開發(fā)。

芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，且具有抗逆性、耐高溫、易貯存等生物學(xué)特性，分布廣泛，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，是一種理想的生防微生物［1］。近年來(lái)，芽孢桿菌的生態(tài)、生理和防病作用以及在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的巨大應(yīng)用潛力，已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

1 芽孢桿菌殺蟲劑

全世界已有30多個(gè)國(guó)家的100多家公司共生產(chǎn)出150多個(gè)品種的細(xì)菌殺蟲劑［2］，制成產(chǎn)品并廣泛應(yīng)用的主要有蘇云金芽孢桿菌 (B．thuringiensist)、日本金龜子芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌4種［3］，其中蘇云金芽孢桿菌是當(dāng)今研究最多的殺蟲細(xì)菌，其制劑被用來(lái)防治150多種害蟲 (主要是鱗翅目害蟲)。

1.1 蘇云金芽孢桿菌

蘇云金芽孢桿菌是一種廣泛存在的產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性菌，主要有庫(kù)斯塔克、日本、擬步甲和以色列4個(gè)亞種。在孢子形成過(guò)程中，產(chǎn)生伴孢晶體、朊蛋白和晶體包含體。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲活性成分主要是其在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的不同類型的殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal protein，ICP)。目前，已經(jīng)找出了數(shù)十種生物殺蟲活性成分，胞外因子有酶類:幾丁質(zhì)酶，磷脂酶C，溶血素，VIP殺蟲蛋白;醇類:雙效菌素;核苷類:蘇云金素。胞內(nèi)因子有蛋白質(zhì):殺蟲晶體蛋白，免疫抑制因子A，腸毒素;芽孢:活芽孢［4］。除了產(chǎn)生內(nèi)毒素，許多蘇云金芽孢桿菌本身對(duì)昆蟲來(lái)說(shuō)也是很強(qiáng)的致病菌。已經(jīng)分離得到蘇云金芽孢桿菌許多與ICP有關(guān)的基因，經(jīng)過(guò)修剪并將其導(dǎo)入作物中，使作物本身也具有殺蟲能力。例如孟山都公司將蘇云金芽孢桿菌kurstaki亞種的cry1A(c)基因轉(zhuǎn)入棉花和番茄中［5］。

蘇云金芽孢桿菌菌系的研究主要在2個(gè)方面，一是尋找自然存在的蘇云金芽孢桿菌新菌系;二是利用分子生物學(xué)技術(shù)將已確定的蘇云金芽孢桿菌菌系進(jìn)行改造，研發(fā)殺蟲活性更高、防治譜更廣的生防菌［6］。利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)篩選的蘇云金芽孢桿菌菌株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，拓寬殺蟲譜。例如Crickmore等［7］將具鞘翅目活性的cry3A基因?qū)胍陨衼喎N后，重組菌株不僅增加了對(duì)鞘翅目昆蟲的毒性，還產(chǎn)生對(duì)鱗翅目大菜粉蝶的毒性。通過(guò)改造ICP基因結(jié)構(gòu)，提高毒蛋白活性。美國(guó)Sandoz公司通過(guò)改變蘇云金芽孢桿菌的wuhanensis亞種的毒蛋白氨基酸組成，使殺蟲毒性提高了2～3倍。在構(gòu)建蘇云金芽孢桿菌基因工程菌時(shí)，增加ICP基因拷貝數(shù)可以提高ICP基因表達(dá)量。利用輔助蛋白的增效作用，也可以增加ICP晶體蛋白的表達(dá)量。Wu等［8］最早注意到27 Ku蛋白能提高65 Ku及130 Ku蛋白殺蚊毒力。Adams等［9］研究也表明，存在于cry4D操縱子中的20 Ku蛋白能顯著增加cryA在大腸桿菌中的表達(dá)量。另外還可通過(guò)增加ICP基因拷貝數(shù)和對(duì)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)改造來(lái)提高ICP晶體蛋白的表達(dá)量，提高殺蟲能力。

1.2 球形芽孢桿菌

球形芽孢桿菌是一種嚴(yán)格需氧微生物，其殺蟲譜比蘇云金芽孢桿菌窄，一般僅對(duì)蚊蟲有毒性。在球形芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)有2類不同的殺蟲毒素，一類是二元毒素 (Bin毒素)，另一類是殺蚊毒素 (Mtx毒素)［10］。由于球形芽孢桿菌的芽孢和晶體在環(huán)境中持效期長(zhǎng)，并有可能在環(huán)境中再循環(huán)，適用于防治污水中的淡色庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊，因此，對(duì)球形芽孢桿菌高毒菌株的篩選受到廣泛重視［11］。迄今，美國(guó)、法國(guó)和中國(guó)等多個(gè)國(guó)家研制了其液劑、乳劑和粉劑等10余種產(chǎn)品。到目前為止，中國(guó)每年生產(chǎn)球形芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)制劑在150 t左右，每年應(yīng)用面積2 000 hm2以上，已成為世界上球形芽孢桿菌生產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣、應(yīng)用效果最佳的國(guó)家。2001年，中國(guó)第一個(gè)利用球形芽孢桿菌C3-41研制的殺蚊商品制劑 (康寶)已獲批準(zhǔn)生產(chǎn)和應(yīng)用［12］。

對(duì)球形芽孢桿菌的研究主要利用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)提高持效期、擴(kuò)大殺蚊普。山東省寄生蟲病防治研究所構(gòu)建了一株基因工程藻類，把含有球形芽孢桿菌蛋白基因穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)入魚腥藻 (pDc26)中，當(dāng)工程藻細(xì)胞的濃度在6.0×105個(gè)·mL-1以上時(shí)，48 h可殺死99%～100%蚊幼蟲。連續(xù)觀察2個(gè)多月，該基因工程藻仍有明顯的殺蚊效果，比單獨(dú)使用球形芽孢桿菌效果更好［13］。

1.3 日本金龜子芽孢桿菌

金龜子芽孢桿菌主要通過(guò)芽孢感染和傳播，在幼蟲消化道內(nèi)萌發(fā)成桿狀營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)吞噬作用進(jìn)入中腸細(xì)胞。金龜子芽孢桿菌在普通培養(yǎng)基上很難生長(zhǎng)，在特殊培養(yǎng)基上雖可進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但產(chǎn)芽孢仍然受到限制;在離體情況下，即使產(chǎn)生芽孢，這種芽孢毒力也比幼蟲體內(nèi)產(chǎn)生的芽孢毒力大大降低。緩死芽孢桿菌的培養(yǎng)條件比金龜子芽孢桿菌的更加苛刻，均為專性寄生菌，在自然界發(fā)病率較高，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前日本金龜子芽孢桿菌孢子粉只能通過(guò)活體金龜子幼蟲進(jìn)行繁殖［14］。目前，僅有2家美國(guó)公司生產(chǎn)和出售日本金龜子芽孢桿菌制劑，分別是Fairfax生物實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的制劑Doom和Japidemic，Rruter實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的制劑 Milk-Spore［13］。

1.4 其他殺蟲芽孢桿菌

青蟲菌和殺螟桿菌都是好氣性蠟狀芽孢桿菌。青蟲菌屬低毒殺蟲劑，對(duì)害蟲具有胃毒作用，而對(duì)蜜蜂和昆蟲天敵無(wú)害，能夠?qū)κ卟?、水稻等害蟲進(jìn)行有效防治。殺螟桿菌是從中國(guó)感病稻螟蟲尸體內(nèi)分離得到的，主要防治水稻、玉米、蔬菜、茶葉等作物的鱗翅目害蟲。另外，日本研制的森田芽孢桿菌制劑Labillus，主要用于衛(wèi)生害蟲的防治，將其拌入雞飼料中，可抑制96%～99%的家蠅成蟲羽化［15］。徐婉學(xué)等［16］報(bào)道了側(cè)孢芽孢桿菌 AS1.864菌株對(duì)三帶喙庫(kù)蚊、尖音庫(kù)蚊、白紋伊蚊等具有殺蟲活性。還有一些昆蟲病原芽孢桿菌，如蠟狀芽孢桿菌、幼蟲芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌等。另縮短梭菌和天幕蟲梭菌通過(guò)昆蟲體培養(yǎng)制備的菌劑可用于一些毒蛾類幼蟲的防治。

2 芽孢桿菌殺菌劑

芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群，具有很強(qiáng)的抗逆能力和抗菌防病作用，許多性狀優(yōu)良的天然分離株已成功地應(yīng)用于植物病害的生物防治。芽孢桿菌可防治棉花枯萎病、小麥全蝕病、稻瘟病、葉枯病、黃瓜苗期猝倒病、馬鈴薯瘡痂病、蔬菜苗期立枯絲核菌、菠菜枯萎病、小麥赤霉病、蘋果紅癌病、小麥根腐病、蘋果輪紋病等多種植物病害［17］。目前芽孢桿菌活體殺菌劑商品不多［18-19］(表1-2)，但發(fā)展?jié)摿薮螅饕性谘挎邨U菌對(duì)植物病害防治上的應(yīng)用。

2.1 枯草芽孢桿菌

美國(guó)已有 GB03、MB1600、QST713和 FZB244株枯草芽孢桿菌生防菌獲得環(huán)保局商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可［20］。澳大利亞開發(fā)的B．subtilis A-13對(duì)麥類和胡蘿卜的立枯病以及其他土傳病害具有很好的防效，并對(duì)作物有一定的增產(chǎn)作用［21］。日本東京技術(shù)研究所的 B．subtilis RB14和 B.subtilis NB22分別對(duì)Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum 和 Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效［22］。

中國(guó)已開發(fā)出一批生物防治作用優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株 (如 B916，B908，B3，B903，BL03，XM16)、蠟樣芽孢桿菌 R2、短小芽孢桿菌(Bacillus pumillus)A3和增產(chǎn)菌系列。江蘇農(nóng)科院植保所開發(fā)的B.subtilis B916已進(jìn)行農(nóng)藥登記，對(duì)水稻紋枯病田間防效持續(xù)10年穩(wěn)定在50%～80%［23］;南京農(nóng)業(yè)大學(xué)分離的B.subtilis B3，商品名為麥豐寧，對(duì)小麥紋枯病田間防效達(dá)50%～80%;劉穎等［24］分離的B.subtilis TG-26和林福星等［25］分離的 Bacillus spp.Xh222、B.subtilis B034對(duì)不同的病原菌有強(qiáng)烈的抑制作用;林東等［26］分離的枯草芽孢桿菌S-0113對(duì)Trichothecium roseum、Fusarium spp.等抑制效果達(dá)到100%;辛玉成等［27］分離得到的枯草芽孢桿菌CN620菌劑對(duì)Glomerellaso、Alernaria、Trichothercium、Roserm、Pesutalotia spp．5種板栗爛果病的抑制作用均達(dá)到100%;李宏科等［28］研究發(fā)現(xiàn)，生防菌 BS-98能強(qiáng)烈抑制Physalaspora prioicola、蘆葦枯萎病菌等植物致病菌。

表1 芽孢桿菌活體殺菌劑主要產(chǎn)品

2.2 其他殺菌芽孢桿菌

崔云龍等［29］研究表明，短小芽孢桿菌D82對(duì)小麥根腐病有強(qiáng)抗生作用;王靜等［30］報(bào)道，短小芽孢桿菌AR03菌體和發(fā)酵液對(duì)煙草黑脛病菌具有拮抗活性，AR03對(duì)煙草黑脛病菌和青枯病具有可持續(xù)控病作用;連玲麗等［31］報(bào)道，短小芽孢桿菌EN16可以誘導(dǎo)番茄對(duì)細(xì)菌性青枯病的抗性;紀(jì)兆林等［32-33］試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌W10、多粘類芽孢桿菌W3和多粘類芽孢桿菌Y2對(duì)蘋果輪紋病菌、柑橘炭疽病菌和柑橘青霉病菌有明顯的抑制作用，其中W10菌株的抑制最強(qiáng)，不僅抑制病菌菌絲生長(zhǎng)，破壞菌絲細(xì)胞，還能抑制病菌分生孢子的產(chǎn)生和芽管的伸長(zhǎng)。

果實(shí)離體試驗(yàn)表明，地衣芽孢桿菌W10可延遲果實(shí)腐爛，降低果腐率，抑制病斑擴(kuò)展。因此，地衣芽孢桿菌W10在水果采后病害的防治上具有較大的應(yīng)用潛力。彭化賢等［34］從水稻根部分離篩選得到一株地衣芽孢桿菌，其對(duì)稻瘟病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，通過(guò)連續(xù)2年的田間防效病果測(cè)試，防效均在50%以上。Sid Ahemd［35］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌可增強(qiáng)角素抑制辣椒根腐病的活性?？梢?，地衣芽孢桿菌除了對(duì)一些植物致病菌有拮抗活性外，還對(duì)某些藥劑具有一定增效作用。

趙德立等［36］報(bào)道，多粘芽孢桿菌JW-725對(duì)柑橘青霉具有很強(qiáng)的抑制作用;王笑穎等［37］篩選得到一株對(duì)大麗輪枝菌具有較強(qiáng)拮抗活性的多粘芽孢桿菌7-4，對(duì)棉花黃萎病具有良好的防效。由此可見，多粘芽孢桿菌在生物防治方面也具有重要的研究?jī)r(jià)值。另外，像蠟質(zhì)芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌等也有報(bào)道表明具有良好的生物防效。劉貫鋒［38］對(duì)芽孢桿菌分類學(xué)和生防功能菌的篩選研究表明，共有11株芽孢桿菌對(duì)青枯雷氏爾菌有拮抗作用;對(duì)大腸桿菌有拮抗作用的菌株也為11株;另篩選出對(duì)香蕉枯萎病菌有拮抗作用的芽孢桿菌16株。因此，芽孢桿菌生物防治具有巨大的研究和應(yīng)用價(jià)值。

表2 美國(guó)EPA已登記注冊(cè)的芽孢桿菌

3 小結(jié)與展望

隨著一些化學(xué)農(nóng)藥逐漸被禁止使用和生產(chǎn)，微生物農(nóng)藥逐漸占據(jù)應(yīng)用市場(chǎng)，芽孢桿菌作為活體農(nóng)藥防治植物病蟲害的巨大潛能正日益受到人們的高度關(guān)注。與傳統(tǒng)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)較低。美國(guó)是生物農(nóng)藥登記最多的國(guó)家，美國(guó)環(huán)保局(EPA)公布了已登記注冊(cè)的芽孢桿菌數(shù)達(dá)到28種［39-40］，占總的生物農(nóng)藥的8.78%，未來(lái)這一比重將逐漸增大。

芽孢桿菌作為殺蟲劑已經(jīng)取得了一定的成功，但目前所占市場(chǎng)份額不足1%，主要是由于存在一些不足之處，例如殺蟲譜窄，不能對(duì)在作物內(nèi)部取食的害蟲起作用;環(huán)境因素的影響，持效期短;易受其他微生物的作用而失效等。不過(guò)這也為改進(jìn)活體殺蟲劑起到了指示作用。

生物防治植物病害，芽孢桿菌無(wú)疑是研究和應(yīng)用最多的。目前，芽孢桿菌拮抗基因的分離克隆、表達(dá)調(diào)控和遺傳改良等研究已在國(guó)內(nèi)外引起了高度的重視，芽孢桿菌作為活體農(nóng)藥展示了美好的前景?，F(xiàn)在對(duì)活體農(nóng)藥的研究范圍還不是十分廣泛，迫切需要拓展新的研究方向。隨著現(xiàn)代遺傳工程技術(shù)的發(fā)展和環(huán)保觀念的深入人心，芽孢桿菌作為活體農(nóng)藥將逐步替代傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥。

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