高效液相色譜法測定紅細胞中膽固醇的含量

郭建芳，田振虎，朱萍，張硯敏，陳萍 （.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽7046；.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安70003）

近年來的研究表明［1－2］，紅細胞中膽固醇與多種疾病如冠心病、原發(fā)性高血壓、糖尿病、肝臟疾病等的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，與血漿中膽固醇的含量相比，紅細胞中膽固醇含量的變化更能直接的反應(yīng)機體的病理變化，對疾病的預(yù)測和檢驗有著更為重要的作用。因此，體外檢測紅細胞中膽固醇水平作為了解其與某些疾病關(guān)系的重要手段而日益受到重視，與之相應(yīng)的檢測方法也隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展而不斷的發(fā)展和進步。紅細胞中膽固醇測定方法主要為酶聯(lián)試劑顯色法［3］、化學(xué)修飾電極測量法［4］等，未見高效液相色譜法檢測紅細胞中膽固醇含量的文獻報道。

1 材料

2690高效液相色譜儀（Waters公司），996型二極管陣列檢測器；BP211D 型電子天平（Sartorius公司）；KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水機（Millipore 公 司）；乙 腈（HPLC 級，F(xiàn)isher 公 司）；異 丙 醇（HPLC級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（AR級，廣東光華科技股份有限公司）；氯化鈉（AR 級，西安化學(xué)試劑廠）；膽固醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111618－200301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Boston Green ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）120 A；乙腈－異丙醇（85∶15）作為流動相，等度洗脫；流速為1.0mL·min－1；檢測波長為210 nm，柱溫為室溫；進樣量20μL。進樣前均以0.45μm微孔濾膜過濾。

2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：取膽固醇對照品適量，精密稱定，于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含94.512μg的溶液，即得對照品溶液。（2）供試品溶液：取1 mL 抗凝血，在2 500 r·min－1離心10 min，去上清，取下層沉淀用等體積生理鹽水洗滌2 次，去上清，沉淀加入KOH 飽和溶液1 mL，甲醇5 mL，40 ℃超聲皂化1 h。上述溶液中加入15%三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，靜置2 h。加入正己烷－異丙醇（3∶1）的混合溶液5 mL，超聲30 min提取，重復(fù)3次，合并提取液。將提取液用純化水洗滌至中性，揮干，用2 mL 甲醇溶解，即得。（3）空白溶液：取純化水1 mL，按照供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 方法與結(jié)果［5］

2.3.1 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 對照品（A）、供試品（B）和空白溶液（C）的HPLC色譜圖1－膽固醇Fig 1 HPLC chromatograms of reference substance（A），sample（B）and blank solvent（C）1－cholesterol

2.3.2 定量限 取對照品溶液（393.8μg·mL－1），進樣1 μL，記錄色譜圖。并對色譜系統(tǒng)進行基線檢測，以基線噪聲的10倍為定量限，結(jié)果測得定量限為393.8 ng（S／N＝10）。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋成每1 mL含393.8μg的溶液。再以此溶液稀釋成每1 mL 含19.69，59.07，118.14，177.21，295.35μg的 溶液，精密吸取上述溶液20μL注入液相色譜儀，測定，以對照品峰面積Y 對質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）進行線性回歸，得回歸方程為：Y＝4 418.4 X－39 172，r＝0.999 8。

2.3.4 精密度試驗 取對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，測得對照品和供試品溶液峰面積的RSD 分別為1.78%，1.21%，表明該方法精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液20μL，按“2.1”項下色譜條件，分別于0，3，6，9，12，18，24，36，48 h進樣，測得峰面積RSD 為1.85% （n＝9），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批次的樣品，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定。結(jié)果測得平均含量為389.08μg·mL－1，RSD 為1.46% （n＝6）。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 回收率試驗 取已知含量的血樣9份，每份1 mL，分離出紅細胞后，分成3 組，分別精密加入含膽固醇393.8 μg·mL－1的對照品溶液0.3，0.6，1.2 mL，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定，分別計算低、中、高3組濃度下的平均回收率、總平均回收率和總RSD，結(jié)果見表1。試驗結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.8 樣品測定 分別取血樣3份，按“2.2”項下方法制備紅細胞供試品溶液。另取血樣3份，每份1 mL，加入KOH飽和溶液2 mL，甲醇10 mL，40 ℃超聲皂化1 h。其余參考“2.2”項下方法。制備全血的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算每1 mL血中紅細胞膽固醇含量以及1 mL血中膽固醇含量。結(jié)果見表2。

表2 膽固醇含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of determination of cholesterol（n＝3）

3 討論

3.1 紅細胞的分離考察 全血經(jīng)過離心［6］后可將紅細胞與血漿分離，試驗證實用等體積（紅細胞）的生理鹽水清洗，第2次洗液中幾乎不含膽固醇，第3次洗液未檢出膽固醇，因此確定紅細胞洗滌2次，即可完全去除血漿。

3.2 膽固醇皂化條件篩選 本試驗采用單因素試驗對皂化溫度、皂化時間進行了考察，結(jié)果皂化溫度為40 ℃，皂化時間為1 h的條件下可達到最佳皂化效果，皂化完成后溶液澄清無沉淀物。

3.3 膽固醇提取工藝篩選 本試驗采用了L9（34）正交試驗，對提取溶劑、提取次數(shù)、提取時間進行考察。其中提取溶劑的種類在預(yù)試驗中已經(jīng)確定為正己烷和異丙醇的混合溶劑，本次正交主要是針對有機溶劑中正己烷和異丙醇的比例進行調(diào)整，結(jié)果表明，有機溶劑的比例差異對提取效果無明顯差異（P＞0.05），提取次數(shù)和提取時間的不同對提取效果有顯著性的差異（P＜0.05），最終選取提取溶劑為正己烷－異丙醇（3∶1），提取3次，每次30 min的條件為最佳提取條件。

3.4 色譜條件的篩選 參考文獻［7］，通過試驗確定流動相組成。流動相比例為乙腈∶異丙醇（70∶30／80∶20）時，雖然分析時間短，但不能完全分離膽固醇和其他雜質(zhì)，故最終確定為乙腈－異丙醇（85∶15）。測定波長方面，雖然對照品紫外掃描最大吸收波長為在203 nm，但為避免溶劑的干擾，最終采用210 nm 作為測定波長。

3.5 質(zhì)量控制 本文采用高效液相色譜法對紅細胞中的膽固醇含量進行了檢測，能分離膽固醇及其雜質(zhì)，比傳統(tǒng)的測定總膽固醇的方法更客觀、準(zhǔn)確。

［1］ 劉汝勝，席文華.冠心病患者中紅細胞膜總膽固醇含量（CEM）水平的變化分析［J］.中國保健營養(yǎng)，2012，10（2）：3714－3715.

［2］ 鄭才岳.紅細胞膽固醇測定及其臨床意義［J］.人民軍醫(yī)，

1995，2：51－53.

［3］ 周君富.酶法快速測定紅細胞膽固醇含量［J］.浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1993，22（4）：152－155.

［4］ 呂大倫，崔凡，陶紹能，等.嚴(yán)重?zé)齻麑t細胞膜膽固醇含量及紅細胞濾過指數(shù)的影響［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2002，22（2）：70－71.

［5］ 中國藥典.二部［S］.2010：附錄194.

［6］ 吳鈺珩，黃民，湯麗芬，等.一種簡易檢測人紅細胞中6－硫鳥嘌呤濃度的HPLC法［J］.藥物分析雜志，2002，22（2）：237－239.

［7］ 鄒鳳萍，熊鳴，余瓊衛(wèi).等.高效液相色譜檢測巨噬細胞內(nèi)膽固醇的研究［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2007，23（6）：647－650.