南方紅豆杉內生真菌的分離鑒定及其細胞毒活性研究

張慶波 陳玉嬋 李浩華 潘清靈 王磊 李冬利 陶美華 章衛(wèi)民

（1. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 廣東省微生物應用新技術公共實驗室 廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣州 510070；2. 中國科學院南海海洋研究所，廣州 510301）

南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K）為紅豆杉屬（Taxus Linn）植物，主要分布于長江流域、南嶺山脈山區(qū)及河南、陜西（秦嶺）、甘肅等省。自紅豆杉中發(fā)現(xiàn)具有獨特抗癌機制的紫杉醇后，人們開始大量從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇，致使紅豆杉資源遭到嚴重破壞。為解決紫杉醇的新來源，人們采用了各種不同的方法，并取得了一定的成果。1991年，Christen等通過太平洋紅豆杉（Taxus brevifolia）的組織培養(yǎng)獲得了紫杉醇［1］；1994年，Nicolaou等［2］完成了紫杉醇的全合成。1993年，Stierle等［3］從太平洋紅豆杉樹皮內生真菌Taxomyces andreanae的發(fā)酵液中分離得到了紫杉醇，這一發(fā)現(xiàn)使紅豆杉屬植物中內生真菌及其次生代謝產物的研究成為熱點，并發(fā)現(xiàn)許多內生真菌都能夠產生紫杉醇或具有紫杉醇類似結構的代謝產物［47］。本研究對產自廣東的南方紅豆杉進行內生真菌的分離和鑒定，探討南方紅豆杉內生真菌的多樣性，并對分離到的內生真菌的發(fā)酵粗提物進行體外細胞毒活性研究，旨在篩選出具有良好抗腫瘤活性的菌株，為進一步研究其活性次生代謝產物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

南方紅豆杉樣品，包括葉、枝條、果實及樹皮，2008年10月采自廣東省大東山自然保護區(qū)。

Taq酶及其他PCR相關試劑購于大連寶生物工程有限公司，其他分析純化學試劑均為市售。

人神經膠質瘤細胞SF-268、人肺癌細胞NCIH460、人乳腺癌細胞MCF-7，均保存于廣東省微生物研究所。

DMI 3000 B倒置顯微鏡（Leica）；S-3000 N掃描電鏡（日立）；EPS 3501電泳儀（Amersham Pharmacia Biotech）； ImageQuant 350 凝膠成像儀；LAMBDA-E酶標儀（Biotech）；2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱（Shellab）；Mastercycler gradient 5331 PCR儀（Eppendof）；RE-2000旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；THZ-C-1搖床（廣州市正一科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離 將采集的新鮮樣品用流水沖洗，然后用無菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡7 min，取出后用無菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡5-7 min，取出后用無菌水漂洗4次。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5 cm×0.5 cm 的方塊；枝條用無菌手術刀削去四周，取中間部位剪成1 cm長的小段；樹皮用手術刀去掉外皮層后，剪成0.5 cm×0.5 cm小塊；果實剝去外皮，取中間部位，剪成小塊。用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對照。處理好的樣品放入事先準備好的PDA平板（含20 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)基中，26℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取平板中單一菌落進一步純化，純化后的菌株轉接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上，4℃冰箱保存。

1.2.2 內生真菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學鑒定 肉眼觀察分離菌株在PDA平板上的培養(yǎng)特征；用光學顯微鏡觀察菌絲、孢子、產孢結構等形態(tài)特征；用掃描電鏡觀察部分菌株的孢子、產孢結構等特征；參考《真菌鑒定手冊》［8］，對分離菌株進行初步鑒定。

掃描電鏡樣品制備和觀察：將PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10 d的培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊，經3%戊二醛固定5 h，PBS緩沖鹽洗滌；1%鋨酸固定2 h，PBS緩沖鹽洗滌；乙醇、丙酮脫水后，用乙酸異戊酯置換其中的溶劑（2次）。完全脫水后的樣品臨界點干燥3 h，噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.2.2 分子鑒定 總DNA的制備參考王磊等［9］的方法。PCR擴增采用真菌rDNA內轉錄間隔區(qū)（rDNA ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）［10］擴增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20 μL反應體系，通過Ex Taq（TaKa-Ra）進行，反應條件為93℃預變性3 min；93℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應產物利用PCR產物純化試劑盒（QIAGEN）純化，純化后的樣品由廣州景瑞生物科技有限公司進行測序。測序獲得的序列通過BLAST 程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析。

1.2.3 細胞毒活性研究

1.2.3.1 發(fā)酵液提取物的制備 從斜面挑取少許菌絲接種到PDA平板上活化3 d，挑取活化后的菌絲（連同培養(yǎng)基）轉接到裝有500 mL PD培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中，26℃，120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)物抽濾后，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于40℃下減壓濃縮至干，得到發(fā)酵液粗提物備用。

1.2.3.2 發(fā)酵粗提物的細胞毒活性測定 采用MTT法［11］測定發(fā)酵粗提物對腫瘤細胞SF-268、NCIH460和MCF-7的生長抑制率，各粗提物的作用濃度為100 μg/mL，以順鉑作為陽性對照，作用濃度為20 μg/mL，每處理重復3次。

2 結果

2.1 內生真菌的分離及鑒定

從南方紅豆杉的葉、枝條、樹皮及果實中共分離到內生真菌55株，根據(jù)培養(yǎng)特征將這些菌株分成32類，測序后獲得22條不同的序列，將這些序列通過BLAST 程序在GenBank上進行序列相似性檢索分析，結果見表1。

從表1可以看出，分離菌株中能確定種的有膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座菌（Guignardia mangiferae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、暗色節(jié)菱孢（Arthrinium phaeospermum）和細交鏈孢菌（Alternaria alternata）；確定到屬的有炭角菌屬（Xylaria）、毛殼菌屬（Chaetomium）、擬莖點霉屬（Phomopsis）和長蠕孢屬（Helminthosporium）；只能確定為植物內生真菌而未能確定其種屬的有4株；而菌株A213、A220、A239和A241與最相似物種的相似率低，分別為92.1%、94.9%、93.1%和92.3%，有待作進一步鑒定。A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征見圖1及表2。

表 1 分離及測序結果

2.2 內生真菌的抗腫瘤活性

除了菌株A229和A232外，對其余20個菌株的發(fā)酵粗提物進行了體外細胞毒活性測試，結果見表3。從表3中可以看出，有4株內生真菌對神經膠質瘤細胞SF-268的抑制率在50%以上，有2株對肺癌細胞NCI-H460的抑制率在50%以上，有6株對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在50%以上，其中菌株A223和A240對MCF-7的抑制率均在90%以上。

圖1 菌株形態(tài)特征

表 2 菌株A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征

表3 發(fā)酵粗提物細胞毒活性（作用濃度為100 μg/mL）

3 討論

內生真菌在植物體內廣泛分布，這種分布既有一定的宿主或組織專一性，又受宿主生長環(huán)境的影響，具有豐富的多樣性。同一植物在不同的地理區(qū)域具有不同的內生真菌類群分布［12］。紅豆杉的內生真菌多樣性豐富，到目前為止已從紅豆杉屬植物中分離到不少不同種屬的內生真菌（表4）。與已報道的南方紅豆杉內生真菌比較，本研究首次從生長于廣東地區(qū)的南方紅豆杉中分離獲得了以往未見報道的內生真菌，且菌株A213、A220、A239、A241與GenBank中最相似物種的相似率低，是否為新的種屬有待進一步研究。可見，從不同地理區(qū)域的南方紅豆杉中可以獲得不同類群的內生真菌資源。

紅豆杉內生真菌活性次級代謝產物的研究逐漸被人們所重視，已成為研究抗腫瘤藥物和其他藥物的重要資源。如從太平洋紅豆杉植物內生真菌Taxomyces andreanae中分離得到的紫杉醇是一種活性很好的抗微管蛋白聚合的藥物，已經被開發(fā)成為抗腫瘤藥物應用于臨床。此外，人們還從紅豆杉屬植物中分離到能夠產生抗腫瘤活性物質的其他真菌。如王建鋒［27］等從紅豆杉皮層中分離到一株瘤座孢（Tubercularia sp.），發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物在體外有較強的抗腫瘤活性；李桂玲［16］等從三尖杉、南方紅豆杉及香榧中分離到172株植物內生真菌，利用MTT法對其進行活性檢測表明，25株內生真菌對KB人口腔上皮癌或HL-60人白血病細胞具有顯著的抑制作用。本研究對20株內生真菌發(fā)酵粗提物進行細胞毒活性研究，結果有6株對至少1種受試腫瘤細胞株的抑制率在50%以上，占受試菌株總數(shù)的30%，其中菌株A223和A240對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在90%以上，值得對其活性次生代謝產物進行深入研究。

表4 部分南方紅豆杉及其同屬植物中的內生真菌

4 結論

本研究首次從南方紅豆杉中分離獲得了球座菌屬、座腔菌屬、炭角菌屬、節(jié)菱孢屬及長蠕孢屬的內生真菌，豐富了南方紅豆杉內生真菌的種類和數(shù)量；活性研究發(fā)現(xiàn)部分內生真菌的發(fā)酵粗提物具有良好的細胞毒活性。

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