噬菌體展示系統(tǒng)表達(dá)玉米赤霉烯酮模擬表位肽

徐富勇 徐玲 劉仁榮 裘雪梅 朱立鑫

（1.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，南昌 330029； 2.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，污染的食物種類繁多，對(duì)動(dòng)物和人體都有較強(qiáng)的毒副作用。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是非類固醇雌激素霉菌毒素，主要源于鐮刀菌［1］。ZEN的產(chǎn)生是一個(gè)長(zhǎng)期陰冷潮濕與多因素相互作用的結(jié)果，如谷物的水分含量，感染情況，溫度和微生物作用等，以及其他未知因素［2］。在玉米、高粱、小麥、大麥燕麥，以及由此為原料制作的食品中都能找到ZEN的蹤跡［3，4］。在摩洛哥，ZEN已經(jīng)在玉米中被發(fā)現(xiàn)，平均含量為14 ng/g［5］，在保加利亞的小麥中，ZEN是主要的霉菌毒素，占69%，平均含量為17 ng/g［6］。由于這種霉菌毒素的誘變、遺傳毒性和致癌作用尚不清楚，國(guó)際癌癥研究中心（IARC）將其歸為3 類致癌物質(zhì)［7］。但是有人提出ZEN和人類的子宮頸癌和子宮內(nèi)膜增生之間可能存在聯(lián)系［8］，另有學(xué)者［9，10］在中國(guó)發(fā)現(xiàn)，ZEN和食道癌可能有關(guān)系。雖然玉米赤霉烯酮及其衍生物和人類的潛在致癌性之間的聯(lián)系仍然存在爭(zhēng)議，但在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物試驗(yàn)中，已取得其具有致癌性的有力證據(jù)［11］。

目前常用檢測(cè)ZEN的方法有熒光光度計(jì)法［12］、氣相色譜法［13］、高效液相色譜法［14］及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15］等，但這些技術(shù)都存在操作要求和成本偏高等問(wèn)題。ELISA具有檢測(cè)速度快，靈敏度高，可定量，操作簡(jiǎn)便，成本低等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種真菌毒素的快速檢測(cè)。但ELISA方法中需要使用ZEN標(biāo)準(zhǔn)品合成人工抗原，由于ZEN對(duì)人體有危害性，而且其標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，獲取困難，所以開(kāi)發(fā)出一種能模擬ZEN反應(yīng)原性，能代替ZEN進(jìn)行試驗(yàn)的無(wú)毒物質(zhì)顯得很有必要。本試驗(yàn)在何慶華等［16］研究的基礎(chǔ)上，查詢到ZEN模擬表位肽為DAVILLM，多肽對(duì)應(yīng)堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG。pC89是帶有來(lái)源于f1噬菌體的gpⅧ、f1噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，以及在pMBI質(zhì)粒基礎(chǔ)上新添加兩個(gè)酶切位點(diǎn)BamHⅠ和EcoRⅠ而的到的噬菌粒。gpⅧ較小，適合融合模擬表位這類較小的肽段，而且gpⅧ拷貝數(shù)極多，可達(dá)2 700個(gè)，在高密度表達(dá)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。pC89S4是改進(jìn)的pC89，它在BamHⅠ與EcoRⅠ酶切位點(diǎn)之間引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，在酶切驗(yàn)證時(shí)更直觀準(zhǔn)確。通過(guò)構(gòu)建pC89-CZEN表達(dá)載體，將含有玉米赤霉烯酮抗原表位基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，用KM13超感染后，純化得到玉米赤霉烯酮抗原表位的噬菌體顆粒，結(jié)合ELISA測(cè)定方法，驗(yàn)證表達(dá)的模擬多肽的反應(yīng)原性的同時(shí)檢測(cè)其表達(dá)效果，以期開(kāi)發(fā)出來(lái)可以代替ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的無(wú)毒檢測(cè)ZEN毒素的ELISA試驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1、XL1-Blue（江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存）； pC89S4噬菌粒（第三軍醫(yī)大學(xué)免疫研究所萬(wàn)瑛教授惠贈(zèng)）；輔助噬菌體KM13（江西科技師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存）；限制性內(nèi)切酶 EcoR I、BamH I、Xba I、T4 DNA 連接酶及PCR擴(kuò)增套裝（寶生物工程（大連）有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒（深圳Fermentas公司）；DNA Marker（杭州愛(ài)思進(jìn)生物公司）；人工抗原BSA-GMBS-ZEN（本實(shí)驗(yàn)室合成）；寡聚核苷酸單鏈T1、T2由上海Sangon合成并測(cè)序；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（Sigma公司）；ZEN抗體（南昌博恒生物工程公司）；洗板機(jī)（Thermo公司）；酶標(biāo)儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構(gòu)建 ZEN模擬表位肽為DAVILLM，對(duì)應(yīng)堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG，考慮到原模擬表位是表達(dá)在pⅢ蛋白的N-末端［16］，而PⅧ噬菌體展示載體表達(dá)的多肽在其N-末端會(huì)有部分前導(dǎo)肽表達(dá)。因此，在模擬表位前設(shè)計(jì)一腸激酶酶切位點(diǎn)（DDDDK），在表達(dá)后應(yīng)用腸激酶酶切，可使模擬表位表達(dá)在pⅧ蛋白的N-末端。其對(duì)應(yīng)堿基序列為：GACGACGACGACAAG，加上EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)接頭，因此設(shè)計(jì)：

T1：5'- AATTCGACGACGACGACAAGGATGCT GTCATCCTGTTGATG-3'，

T2：5'- GATCCATCAACAGGATGACAGCATCCT TGTCGTCGTCGTCG-3'。

將T1和T2加ddH2O分別配成20 nmol/mL 的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μL，混勻后置于PCR儀，99℃保溫5 min后緩慢降至室溫，-20℃保存。pC89S4噬菌粒5 μL，加入ddH2O 11 μL，酶切緩沖液2 μL，EcoR I和BamH I各1 μL，混勻后37℃雙酶切2 h，按照PCR純化試劑盒所述步驟純化酶切產(chǎn)物。退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在T4DNA 連接酶作用下16℃連接8 h，乙醇沉淀法純化。連接液全量電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，加入SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后涂布含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落用于擴(kuò)增細(xì)胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒依次用Xba I、EcoR I和BamH I進(jìn)行單酶切，時(shí)間2 h，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。酶切驗(yàn)證為陽(yáng)性的質(zhì)粒采用M13-40引物測(cè)序。

1.2.2 敏感宿主菌的制備及輔助噬菌體的擴(kuò)增

（1）將TG1接種至2 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)活化2次。活化后的菌液接種至加富M9培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天于加富M9平板上挑取10個(gè)單菌落分別接種至2 mL LB（含40 μg/mL 四環(huán)素）中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。經(jīng)過(guò)適度稀釋的KM13噬菌體原液與對(duì)數(shù)期的TG1菌液混合，37℃靜置水浴20 min后與頂層瓊脂混勻，將頂層瓊脂傾倒于LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察噬菌斑，鑒定細(xì)菌對(duì)KM13噬菌體的敏感性。

（2）選擇對(duì)KM13噬菌體敏感的細(xì)菌制備鋪平板細(xì)菌。將敏感菌劃線接種加富M9平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天挑取單菌落接種2 mL LB（含有終濃度40 μg/mL 四環(huán)素），37℃，220 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期。準(zhǔn)備KM13噬菌體10-1至10-12稀釋度的LB懸液，取10-8至10-12稀釋度各10 μL與鋪平板細(xì)菌混合均勻，37℃靜置水浴20 min后與45℃溫育的頂層瓊脂快速混合倒于LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

（3）挑取一個(gè)完整噬菌斑接種至對(duì)數(shù)期的2 mL TG1菌液中，37℃，220 r/min培養(yǎng)1 h后將菌液轉(zhuǎn)入20 mL LB（含40 μg/mL 四環(huán)素，40 μg/mL卡那霉素），37℃，220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.3 輔助噬菌體提取純化及滴度測(cè)定 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4℃，5 000 r/min，20 min離心去除細(xì)菌，上清加入總體積1/6的20% PEG8000，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。再4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后加入總體積1/6的20% PEG80-00，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后4℃，10 000 r/min，5 min，收集上清液。

用LB培養(yǎng)基將收集到的上清液按梯度稀釋為10-1-10-11，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。按照1.2.2的方法進(jìn)行噬菌斑的計(jì)數(shù)，計(jì)算公式：

PFU（mL）=（噬菌斑數(shù)/接種噬菌體積） ×（1/噬菌體稀釋度）

1.2.4 輔助噬菌體超感染及噬菌體展示模擬表位的提取純化 將經(jīng)測(cè)序鑒定成功的工程菌pC89-ekzen劃線于LB平板（含50 μg/mL 氨芐青霉素，40 μg/mL 四環(huán)素），37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第2天挑取取單菌落接種至20 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)早期。通常OD600=2.0時(shí)，細(xì)菌密度約為1.6×109細(xì)胞/mL［17］。取1 mL菌液，按照感染復(fù)數(shù)為40加入已測(cè)定滴度的噬菌體后混勻［18］，37℃靜置20 min超感染；超感染后的菌液轉(zhuǎn)入至60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；再加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）繼續(xù)24℃，220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)［19］。

1.2.5 噬菌體展示模擬表位高效表達(dá)的ELISA檢測(cè) 將提取純化的表位噬菌體用50 mmol/L TBS（pH7.5）稀釋至A280=0.3，稀釋后的噬菌體每100 μL加入1 μL腸激酶，22℃，酶切16 h。酶切后的噬菌體用0.01 mol/L的PBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋，連接有BSA的5 μg/mL人工抗原ZEN-BSA作為陽(yáng)性對(duì)照，0.01 mol/L的PBS作為陰性對(duì)照，每孔包被100 μL，37℃孵育2 h；以PBS-T20為清洗液，洗板機(jī)洗板3次，5%脫脂乳37℃下封閉1 h；PBS-T20洗板4次，每孔加入1：10 000的ZEN抗體100 μL，37℃孵育45 min；然后PBS-T20洗板4次，加入1∶3 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗100 μL，37℃孵育45 min；接著用PBS-T20洗板5次，TMB顯色液顯色10 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光值。

1.2.6 噬菌體展示模擬表位的表達(dá)優(yōu)化

1.2.6.1超感染時(shí)菌體濃度OD600的優(yōu)化 待菌體OD600分別達(dá)到0.2、0.4、0.6、0.8后加入感染復(fù)數(shù)為40的輔助噬菌體超感染，超感染后的菌液轉(zhuǎn)入至60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，24℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8 h，提取純化的表位噬菌體進(jìn)行ELISA檢測(cè) 。

1.2.6.2 加入IPTG誘導(dǎo)時(shí)菌體濃度OD600的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時(shí)加入感染復(fù)數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，待菌體OD600分別達(dá)到0.2、0.4、0.6、0.8時(shí)，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L ，24℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8 h，提取純化的表位噬菌體進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.6.3 IPTG終濃度的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時(shí)加入感染復(fù)數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L，24℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8 h，提取純化的表位噬菌體進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.6.4 表達(dá)溫度的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時(shí)加入感染復(fù)數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，分別于24℃和37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)8 h，提取純化的表位噬菌體進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.6.5 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時(shí)加入感染復(fù)數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于24℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4、6、8、10 h，提取純化的表位噬菌體進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構(gòu)建

退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接純化后，電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞。從單菌落擴(kuò)增出來(lái)的細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒后，用Xba I、EcoR I和BamH I進(jìn)行單酶切。pC89S4具有兩個(gè)Xba I酶切位點(diǎn)，相距147 bp，經(jīng)Xba I酶切后能產(chǎn)生兩段大小不同的片段。但重組質(zhì)粒中插入的目的片段取代了一個(gè)Xba I酶切位點(diǎn)，因此3種酶都只有一個(gè)酶切位點(diǎn)。由圖1可知，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Xba I、EcoR I和BamH I酶切之后都能得到同等大小的單一條帶，說(shuō)明質(zhì)?？赡苁侵亟M質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序，結(jié)果顯示其序列與預(yù)期一致，證明表達(dá)載體pC89-CZEN構(gòu)建成功，如圖2。

2.2 輔助噬菌體滴度測(cè)定

經(jīng)平板計(jì)數(shù)，稀釋度為10-8時(shí)噬菌斑平均大于300個(gè)，10-9時(shí)平均為67個(gè)，10-10時(shí)平均為8個(gè)，因此選取稀釋度為10-9進(jìn)行計(jì)算：

KM13滴度= （噬菌斑數(shù)/接種噬菌體體積）× （1/噬 菌 體 稀 釋 度） = （67/0.01） × （1/10-9） =6.7×1012/mL

2.3 噬菌體展示模擬表位的表達(dá)優(yōu)化

2.3.1 超感染時(shí)菌體濃度OD600的優(yōu)化 由圖3可知，當(dāng)菌體濃度OD600為0.4時(shí)進(jìn)行超感染，提取的ZEN模擬表位肽與抗體結(jié)合后的A450值最高。

2.3.2 加入IPTG誘導(dǎo)時(shí)菌體濃度OD600的優(yōu)化 由圖4可知，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的效果隨菌體濃度的上升有所增加，但不是很明顯，至OD600為0.6時(shí)最高，隨后降低。

2.3.3 IPTG終濃度的優(yōu)化 由圖5可知，隨著IPTG終濃度的提高，A450也隨之提高，但不是很明顯。當(dāng)終濃度為1.5 mmol/L時(shí)，A450下降較快，是由于IPTG 對(duì)細(xì)胞存在毒性，濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。

2.3.4 表達(dá)溫度的優(yōu)化 由圖6可知，雖然37℃為大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度，但在此溫度下表達(dá)的模擬表位與抗體的結(jié)合效果卻不如24℃，說(shuō)明在24℃時(shí)更利于模擬表位的表達(dá)。

2.3.5 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化 由圖7可知，隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合效率不斷提高，到8 h后基本不變，出于節(jié)約時(shí)間成本的目的，選擇誘導(dǎo)為8 h。

2.4 腸激酶酶切對(duì)抗體結(jié)合效果的影響

純化后的噬菌體展示模擬表位經(jīng)酶切后與未酶切的同樣進(jìn)行ELISA測(cè)定。經(jīng)酶切與未酶切的噬菌體展示模擬表位與抗體的結(jié)合結(jié)果比較如圖8。從圖8可以看出，酶切后的結(jié)合效果明顯高于酶切前。

3 討論

本試驗(yàn)采用的是絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中，主要的展示蛋白是pⅧ和pⅢ蛋白。用于絲狀噬菌體展示的載體主要有噬菌體載體和噬菌粒載體。噬菌粒是帶有絲狀噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒。pC89S4就是在具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)及氨芐青霉素抗性選擇標(biāo)記的質(zhì)粒上再加上單拷貝的絲狀噬菌體主要基因間隔區(qū)?？寺∮趐C89S4內(nèi)的T1T2片段，可以像質(zhì)粒一樣用常規(guī)方法進(jìn)行增殖。而當(dāng)帶有重組質(zhì)粒的XL1-Blue被KM13輔助噬菌體超感染后，在病毒的基因Ⅱ蛋白影響下，質(zhì)粒的復(fù)制方式發(fā)生改變。基因Ⅱ產(chǎn)物與質(zhì)粒所攜帶的基因間隔區(qū)相互作用，啟動(dòng)滾換復(fù)制，以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA一條鏈的拷貝。這些質(zhì)粒DNA的單鏈拷貝經(jīng)切割產(chǎn)生切口，然后環(huán)化，最后被包裝進(jìn)子代噬菌體顆粒中，進(jìn)而將目的多肽展示在噬菌體表面。

本研究在成功構(gòu)建pC89-CZEN噬菌粒載體的基礎(chǔ)上，對(duì)3個(gè)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)菌體處于對(duì)數(shù)前期時(shí)，更利于輔助噬菌體的吸附侵染。IPTG是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，可與阻遏蛋白結(jié)合成復(fù)合物，而使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，阻遏蛋白就不能結(jié)合到大腸桿菌中的Lac 啟動(dòng)子上，從而使乳糖操縱子能夠被轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)的效果與菌體的狀體和自身的濃度有很大關(guān)系。在對(duì)數(shù)期時(shí)，生長(zhǎng)代謝旺盛，對(duì)一切誘導(dǎo)藥物和環(huán)境因素的作用最為敏感，若加入時(shí)間過(guò)早，可能會(huì)抑制宿主菌的生長(zhǎng)，加入太遲，菌體已成熟，菌體內(nèi)各種酶的合成能力降低，表達(dá)量也減少［20］。IPTG的使用量也有要求，IPTG 具有細(xì)胞毒性，濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低蛋白的表達(dá)。在進(jìn)行低溫24℃表達(dá)時(shí)，更有利于融合蛋白的可溶性蛋白表達(dá)及向胞外分泌，37℃時(shí)更多地以包涵體的方式表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)8 h后，噬菌體量達(dá)最大，對(duì)應(yīng)的模擬表位肽的量也達(dá)到最大，時(shí)間再延長(zhǎng)基本不變。

pC89S4所表達(dá)的外源片段其N-末端殘留有5肽。本實(shí)驗(yàn)室在研究中發(fā)現(xiàn)ZEN模擬表位N-末端的5肽影響了ZEN抗體與模擬表位的結(jié)合。為解決這一問(wèn)題，在ZEN模擬表位5'端引入了腸激酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出噬菌粒pC89-CZEN。腸激酶可沿序列的羧基端切下。成熟的ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后，ZEN模擬表位暴露出來(lái)，提高了與抗體的結(jié)合幾率，為后續(xù)建立無(wú)毒ELISA方法檢測(cè)真菌毒素打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了噬菌粒pC89-CZEN，利用此載體實(shí)現(xiàn)了ZEN模擬表位在噬菌體表面的成功展示。展示有ZEN模擬表的噬菌體純化方法簡(jiǎn)單。ELISA檢測(cè)證實(shí)ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

［1］ Gaumy JL, Bailly JD, Burgat V, Guerre P. Zearalenone：Proprietes et toxicite experimentale［J］. Revue Medecine Veterinaire, 2001, 152（3）：219-234.

［2］ Moss MO. The environmental factors controlling mycotoxin formation［J］. International Journal of Food Microbiology, 2005, 98（3）：223-231.

［3］ Bennet GA, Shotwel OL. Zearalenone in cereal grains［J］. Journal of American Oil Chemists Society, 1979, 56（24）：812-819.

［4］ Caldwell RW, Tuite J, Stob M, Baldwin R. Zearalenone production by Fusarium species［J］. Applied Microbiology, 1970, 20：31-34.

［5］ Zinedine A, Brera CB, Elakhdari S, et al. Natural occurrence of mycotoxins in cereals and spices commercialized in Morocco［J］. Food Control, 2006, 17：868-874.

［6］ Verbcheva T, Gebler R, Ulesber E, Erwin M. First survey on the natural occurrence of Fusarium mycotoxins in Bulgarian wheat［J］. Mycopathologia, 1996, 136（279）：47-52.

［7］ International Agency for Research on Cancer（IARC）.Overall evaluations of carcinogenicity to humans. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans, IARC monographs［J］. Lyon：IARC, 1999, 1：1-36.

［8］ Tomaszewski J, Mitursky R, Semczuk A, et al. Tissue zearalenone concentration in normal, hyperplastic, and neoplastic human endometrium［J］. Ginekologia Polska, 1998, 69：363-366.

［9］ Gao HP, Yoshizawa T. Further study on Fusarium mycotoxins in corn and wheat from a high-risk area for human esophageal cancer in China［J］. Mycotoxins, 1997, 45：51-55.

［10］ Luo Y, Yoshizawa T, Katayama T. Comparative study on the natural occurrence of Fusarium micotoxins（ trichothecenes and zearalenone ）in corn and wheat from high-and low-risk areas for human esophageal cancer in China［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1990, 56：3723-3726.

［11］ Battershill JM, Fielder RJ. Mouse-specific carcinogens：an assessment of hazard and signification for validation of short-termcarcinogenicity bioassays in transgenic mice［J］. Human and Experimental Toxicolology, 1998, 17：193-205.

［12］ Navarro-Villoslada F, Urraca JL, Moreno-Bondi MC. Zearalenone sensing with molecularly imprinted polymers and tailored fluorescent probes［J］. Sensors and Actuators B： Chemical, 2007, 121（1）：67-73.

［13］ Toshitsugu T, Atsushi Y, et al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A, 2000, 882（1）：23-28.

［14］ De Saeger S, Sibanda L, Van Peteghem C. Analysis of zearalenone and α-zearalenol in animal feed using high-performance liquid chromatography［J］. Analytica Chimica Acta, 2003, 487（2）：137-143.

［15］ Berthiller F, Schuhmacher R, Buttinger G, Krska R, Rapid simultaneous determination of major type A- and B-trichothe-cenes as well as zearalenone in maize by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A, 2005, 1062（2）：209-216.

［16］ 何慶華, 劉仁榮, 許楊.利用噬菌體肽庫(kù)淘選玉米赤霉烯酮的模擬表位［J］.食品科學(xué), 2007（8）：241-243.

［17］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T .Molecular cloning a Laboratory Manual［M］. 2nd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989：127.

［18］ Kang AS, Barbas CF, Janda JD, et al. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces［J］. PNAS, 1991, 88（10）：4363-4366.

［19］ Wan Y , Wu YZ, Bian J, et al. Induction of hepatitis B virusspecific cytotoxic T lymphocytes response in vivo by filamentous phage display vaccine［J］. Vaccine , 2001, 19（20）：2918-2923.

［20］ 陳衛(wèi), 葛佳佳, 張灝, 丁霄霖.半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)及IPTG誘導(dǎo)條件［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào), 2002（5）：492-495.