應(yīng)用基因芯片分析植物內(nèi)生菌醇提取物處理條件下水稻的基因表達圖譜

肖軍 楊濤 楊鎮(zhèn) 王紅 王麗萍 陳珣 肇瑩 王娜 龔娜

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，沈陽 110161）

內(nèi)生菌醇提取物RD為遼寧省農(nóng)科院微生物工程中心經(jīng)過多年潛心研究開發(fā)出來的新一代植物生長調(diào)節(jié)劑，來源于人參和越橘內(nèi)生菌的醇提取物。施用微量即可有效促進水稻的營養(yǎng)生長，提高水稻對氮肥的利用效率［1］，增強水稻的抗病性。內(nèi)生菌醇提取物RD對水稻的作用機制復(fù)雜，機理仍不明確，已成為制約其應(yīng)用的障礙。為了全面認(rèn)清內(nèi)生菌醇提取物RD對水稻的作用機制，僅僅對單個基因的功能進行研究顯然是不夠的，還需要從整個基因組水平上了解水稻的基因表達在內(nèi)生菌醇提取物RD處理后是如何變化的，哪些基因在此過程中真正起作用。要從整個基因組水平上研究內(nèi)生菌醇提取物RD的作用機制，成為當(dāng)前破解內(nèi)生菌醇提取物RD促進水稻生長、增強抗病性機理的關(guān)鍵。

基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的基因組整體研究技術(shù)，它是功能基因組學(xué)研究的重要技術(shù)之一［2，3］，被廣泛應(yīng)用于分析特定生物過程中基因表達的全面信息［4-6］。該技術(shù)可以同時分析成千上萬個基因，所得的數(shù)據(jù)可直接用于基因功能的研究。這樣就可在轉(zhuǎn)錄水平上靈敏、完整地給出細胞或組織樣本的一系列生理狀態(tài)的分析結(jié)果，尋找和鑒定特異性相關(guān)基因，是從分子水平上揭示植物生理機制的一項基礎(chǔ)性研究。

本研究旨在利用基因芯片手段，檢測內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻根部后基因差異表達，探討內(nèi)生菌醇提取物RD能夠促進水稻生長、增強水稻抗病性的作用機制，為這種純天然、綠色的植物生長調(diào)節(jié)劑廣泛應(yīng)用于水稻提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻品種遼星一號，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻作所提供。

1.1.2 內(nèi)生菌醇提取物 內(nèi)生菌醇提取物RD由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心提供。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 水稻遼星一號種子用0.1% HgCl消毒10 min，無菌水沖洗3遍，25℃浸種至水稻露白，沙培培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)7 d的水稻根部浸于濃度為50 ng/mL RD水溶液中，24 h后取出，以無菌水處理為對照，水中再培養(yǎng)24 h。取水稻幼嫩的根部立即投入液氮速凍，然后置-70℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 總RNA提取 根據(jù)Trizol（寶生物公司）說明書分別提取內(nèi)生菌醇提取物RD處理和對照的水稻根系總RNA，用0.8%甲醛變性瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測總RNA中28S rRNA和18S rRNA比例，以檢測RNA樣品的質(zhì)量。用紫外分光光度計檢測RNA的含量和濃度。

1.2.3 對樣品RNA進行熒光標(biāo)記 采用博奧公司晶芯cDNA擴增標(biāo)記試劑盒，對樣品RNA進行熒光標(biāo)記。本研究使用Cy3、Cy5 進行雙色熒光標(biāo)記，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為550 nm/570 nm和649 nm/670 nm。通過探針樣本與芯片上飽和cDNA之間的競爭性雜交，將樣本之間的雜交信號對比，即基因間的差異表達用數(shù)值表示出來。芯片由北京博奧生物芯片公司制備。對提取的總RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen公司）純化總RNA，利用One-cycle cDNA Synthesis Kit（Affymetrix公司）合成dscDNA，并用GeneChip Sample Cleanup Module（Affymetrix公司）純化該cDNA。按照GeneChip IVT Labeling Kit說明書制備生物素標(biāo)記的cRNA，于94℃保溫35 min后進行片段化處理，并作為雜交探針用于基因芯片分析。

1.2.4 基因芯片雜交 用于雜交的基因芯片為Affymetrix公司的Rice Genome Array，產(chǎn)品編號：AFF-900599，芯片覆蓋約51 279個轉(zhuǎn)錄本，代表兩種水稻品系，大約48 564個Japonica品系轉(zhuǎn)錄本和1 260個Indica品系轉(zhuǎn)錄本。序列信息來源于GenBank mRNAs，TIGR基因預(yù)測和國際水稻基因組序列計劃。NCBI UniGene Build #52（May 7，2004），GenBank預(yù)測基因，TIGR Os1 v2 data set.（ftp.tigr.org FASTA，89.3 MB）。

內(nèi)生菌醇提取物RD處理和對照的水稻根部總RNA與芯片雜交，取適量cRNA與試驗芯片（experimentalchip）在45℃的Affymetrix雜交箱640中，60 r/min旋轉(zhuǎn)雜交16 h。在Affymetrix公司Genechip fluidics station洗滌工作站450中進行洗脫和染色。用Affymetrix公司GeneChip Scanner3000高分辨率掃描儀對染色后的芯片進行掃描，利用Affymetrix GeneChip Operating Software Version1.4軟件對芯片掃描所得數(shù)據(jù)進行計算和處理。

1.2.5 基因芯片的數(shù)據(jù)處理 采用Robust Multichip Analysis（RMA）歸一化方法，檢測水稻樣品中每個基因（probe set）的信號值；用P、A、M表示Probe Set的檢測狀態(tài)：P（Present）存在、A（Absent）不存在、M（Marginal）臨界值。并刪除了熒光信號弱的基因以及芯片上的陰性對照、內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)等冗余數(shù)據(jù)。在比較分析兩組雜交結(jié)果時，取內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻樣本和對照樣本同一個基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達水平（信號值）進行比值計算，以上調(diào)或下調(diào)2倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因，即Ratio≥2.0和≤0.5。再用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)（Capital-Bio Molecule Annotation System，MAS）對篩選的差異表達基因進行分析，并注釋差異表達顯著的基因功能。

2 結(jié)果

2.1 水稻總RNA質(zhì)量檢測

在基因芯片雜交中，RNA的質(zhì)量直接影響標(biāo)記效率和試驗的成功率。本研究選取水稻培養(yǎng)7 d的幼嫩根尖，用Trizol法提取其總RNA。用0.8%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示，RNA完整性較好，電泳條帶清晰，28S rRNA比18S rRNA條帶亮度大于11，A260/A280的吸光度比值均在1.86-1.93之間（表1），RNA的質(zhì)量符合后續(xù)芯片試驗要求。

表1 內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻和對照總RNA

2.2 芯片雜交結(jié)果統(tǒng)計

提取內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻和對照試驗的熒光數(shù)據(jù)，校正后將兩張熒光交換的數(shù)據(jù)進行整合做散點圖，通過散點圖可以比較直觀地看出在兩個樣品之間基因表達的差異情況。其中X 軸和Y 軸分別以兩個樣品的熒光信號強度值為坐標(biāo)，圖2中每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上一個基因點的雜交信號，上調(diào)基因、下調(diào)基因及表達基本無差異的基因如圖中所示。以芯片熒光信號對數(shù)值（signal log2ratio）>2以及<0.5為閾值，篩選表達量變化在2倍以上基因，由圖2可以看出試驗中的數(shù)據(jù)點大多數(shù)集中在0.52和<0.5的差異表達基因1 171個，其中上調(diào)671個，下調(diào)基因500個。并且上調(diào)基因中Ratio>3.0的有218個，Ratio>4.0的有115個，下調(diào)基因中差異表達顯著的基因Ratio<0.4有226個，Ratio<0.3的基因有72個。

2.3 差異表達基因的功能注釋

根據(jù)基因芯片的試驗結(jié)果，采用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)V3.0（MAS）和數(shù)據(jù)庫查詢，對內(nèi)生菌醇提取物RD處理獲得的1 171個差異表達基因進行功能注釋（圖3）。其中43.36%基因參與各種生物學(xué)過程（biological process）；20.35%基因與生成各種細胞組分（celluar component）有關(guān)；34.51%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能（molecular function）有關(guān)。1.78%與GenBank中功能未知序列（others）相對應(yīng)，這些基因在內(nèi)生菌醇提取物RD對水稻的促進生長中所起的作用還需進一步研究。差異表達基因的分子功能又歸納為22個功能類群（圖4），主要為生理功能、結(jié)合功能、刺激應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生殖過程、代謝功能。說明內(nèi)生菌醇提取物RD處理影響基因的表達不是某個基因孤立、單一的，而是多方面、多層次共同作用的結(jié)果。表2中列舉了基因表達量變化較大的重要基因及其功能描述。

2.4 代謝途徑的變化情況

采用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)V3.0（MAS）中pathway注釋系統(tǒng)，利用kegg數(shù)據(jù)庫查詢，對內(nèi)生菌醇提取物RD處理后引起水稻代謝途徑的改變進行分析。內(nèi)生菌醇提取物RD處理后代謝途徑的變化存在明顯差異，表達量上調(diào)的代謝途徑數(shù)量多于下調(diào)的數(shù)量。圖5進行了表達量上調(diào)和下調(diào)的代謝途徑比較，期中表達量上調(diào)代謝途徑39條，表達量下調(diào)代謝途徑24條。

3 討論

代謝是作物最基本的生命活動過程。內(nèi)生菌醇提取物RD處理水稻后涉及的代謝途徑非常復(fù)雜。圖5表明，其中表達量上調(diào)最為明顯的代謝途徑有谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、精氨酸、脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、酪氨酸代謝等，光合作用是作物生產(chǎn)最基本

的生理過程之一，也是重要的生物合成過程，植物干物質(zhì)90%以上是通過光合作用合成的，因此是栽培作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，也是碳代謝的一個重要部分。氮代謝為碳代謝提供酶和光合色素，影響著作物光合同化潛力。谷氨酸代謝、脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、酪氨酸代謝等為參與保護、防御和脅迫耐受相關(guān)的代謝途徑。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成對植物蛋白質(zhì)、信息素、抗氧化劑和木質(zhì)素等生物質(zhì)的合成非常重要。

表2 部分差異表達基因

基因表達分析的基礎(chǔ)是基因在生命活動過程中有許多變化，由于基因表達與功能特異性一致，因而能夠根據(jù)基因功能在某個特定生理階段的上調(diào)和下調(diào)變化來推導(dǎo)基因功能［7］。圖4表明，具有催化活性、代謝功能、細胞過程、生理過程、細胞器分子功能的上調(diào)差異表達基因數(shù)量遠高于下調(diào)差異表達基因。表2中列舉了基因表達顯著上調(diào)和下降Ratio>5和Ratio<0.25的部分基因，期中上調(diào)最大的基因Ratio=29.09，水稻鐵載體基因OslRT1［8］，是ZIP基因家族的一種［9］，F(xiàn)e（Ⅱ）轉(zhuǎn)運蛋白作為一種質(zhì)膜蛋白，在將膜外的Fe（Ⅱ）轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)中起關(guān)鍵作用，它與Fe（Ⅲ）-螯合物還原酶共同完成植物對鐵素的吸收［10，11］。草酸氧化酶（oxalate oxidase）又稱萌發(fā)類似蛋白（germin-like protein），馮潔等［12］研究推斷水稻中草酸氧化酶抗病反應(yīng)中的作用可能與麥類作物中的草酸氧化酶相似。細胞色素P450是一類以還原態(tài)與CO結(jié)合后在波長450 nm處有吸收峰的含血紅色素的多功能氧化酶［13］。目前，已從111種植物中獲得1 052個植物細胞色素P450基因，部分P450基因功能已得到鑒定［14］。P450在植物體中具有生物合成和代謝解毒兩大功能，其中一些能催化結(jié)構(gòu)抗病物質(zhì)（如木質(zhì)素、角質(zhì)層和樹脂）、植保素（如異黃酮和甜椒素）、毒素（即殺蟲劑，如生氰糖苷和丁布）、脅迫信號物質(zhì)（茉莉酸、創(chuàng)傷激素和Divinyl ethers）的合成，從而在植物防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［15］。硝酸還原酶（Nitrate reductase）是植物NO3-同化的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)硝酸還原酶活力（NRA）的高低直接影響介質(zhì)中NO3-的利用，被作為作物的營養(yǎng)指標(biāo)之一［16］。許多研究已經(jīng)表明，幾丁質(zhì)酶（Chitinase）在植物體內(nèi)的誘導(dǎo)與積累，對于增強植物防衛(wèi)能力發(fā)揮著重要作用［17］。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測來源于野生植物內(nèi)生菌的醇提取物RD對水稻基因表達差異影響，獲得了差異表達基因1 171個，期中上調(diào)基因671個，下調(diào)基因500個。其中43.36%基因參與各種生物學(xué)過程；20.35%基因與生成各種細胞組分有關(guān)；34.51%基因編碼產(chǎn)物則與執(zhí)行各種分子功能有關(guān)。這些差異表達基因參與了多個生物學(xué)過程，包括各種生理過程、生殖過程、刺激應(yīng)答、代謝功能、生物調(diào)節(jié)等。采用GO注釋系統(tǒng)上調(diào)表達基因分為20種生物功能，影響39條代謝通路，下調(diào)表達基因分為21種生物功能，影響24條代謝通路。

［1］ 肖軍, 肇瑩, 楊濤, 等.內(nèi)生真菌提取物對水稻N肥利用率的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 28（1）：72-75.

［2］ 楊明星, 高志賢, 王升啟.基因芯片及其應(yīng)用［J］.傳感器技術(shù), 2002, 21（6）：54-58.

［3］ Schena M, Shalon D, Davis RW, et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray［J］. Science, 1995, 270：467-470

［4］ 杜士云, 陽菁, 王守海, 等.應(yīng)用基因芯片分析短日低溫條件下新型粳稻光溫敏核質(zhì)互作不育系育性相關(guān)基因［J］.中國水稻科學(xué), 2010, 24（6）：559-566.

［5］ Yowe D, Farlow D, Zora JM, et al. Using microarrays for studying the host transcriptional response to microbial infection［J］. Methods in Microbiology, 2002, 32：157-168.

［6］ Delseny M, Salses J, Cook R, et al. Rice genomics：Present and future［J］. Plant Physiol Biochem, 2001, 39（3-4）：323-334.

［7］ Lorkowski S, Cullen PM. Analysing gene expression：A handbook of methods possibilities and pitfalls［M］. New York：John Wiley and Sons, 2003.

［8］ Bughio N, Yamaguchi H, Nishizawa NK, et al. Cloning an iron regulated metal transporter from rice［J］. J Exp Bot, 2002, 53（374）：1677-1682.

［9］ 韓艷, 李爭艷, 岳修樂, 等.徐世健.高山離子芥鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因編碼序列的克隆及其抗逆性表達的實時定量分析［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2008（6）：549-555.

［10］ Holden MJ, Luster DG, Chaney RL, et al. Fe（Ⅲ）chelate reductase activity of plasma membranes isolated from tomato（Lycopersicon esculentum Mill.）roots：comparison of enzymes from Fe-deficient and Fe-sufficient roots［J］. Plant Physiol, 1991, 97（2）：537-544.

［11］ Robinson NJ, Procter CM, Connolly EL, et al. A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils［J］. Nature, 1999, 397（6721）：694-697.

［12］ Feng J, Makoto T. Identification of rice oxalate oxidase in defence system against rice blast［J］. Journal of Agricultural Biotechnology, 2004, 12（3）：312.

［13］ 冷欣夫, 邱星輝.細胞色素P450酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景［M］.北京：科學(xué)出版社, 2001.

［14］ 戴素明, 周程愛, 謝丙炎, 等.細胞色素P450表達在植物防御反應(yīng)中的作用［J］.石河子大學(xué)學(xué)報, 2004（z1）：184-187.

［15］ Morant M, Bak S, Moller BL, Werck-Reichhart D. Plant cytochromes P450：tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14（2）：151-162.

［16］ 張瑞珍, 張恩和, 孫長占.不同基因型玉米品種氮素營養(yǎng)效率差異的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 25（2）：183-186.

［17］ Bol JF, Linthorst HJ, Comelissen BJ. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection［J］. Ann Rev Phytopathol, 1990, 28：113-138.