產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶細(xì)胞的固定化

鄧 輝，陳 晟，陳 堅(jiān)，吳 敬,*

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase，Xiase，EC 5.3.1.5)，又稱葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GIase)，在胞外可以催化D-葡萄糖至D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，是食品工業(yè)生產(chǎn)上以淀粉為原料制備果葡糖漿的關(guān)鍵酶之一[1]。目前果葡糖漿的生產(chǎn)多采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶，即通過物理、化學(xué)的方法把GIase固定成具有高活力、水不溶性、顆粒狀的固定化酶制劑，由此實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)的連續(xù)化、自動(dòng)化、可控化，并使產(chǎn)品易于分離和精制，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，有力地推動(dòng)了果葡糖漿生產(chǎn)的發(fā)展。

固定化酶制劑主要有兩種，一種為固定化酶，另一種為固定化產(chǎn)酶細(xì)胞。由于天然來源的GIase幾乎均為胞內(nèi)酶，因此產(chǎn)GIase細(xì)胞的固定化相對(duì)GIase酶的固定化省去了酶的分離提取成本，同時(shí)減少了酶活損失，并且GIase的作用底物和產(chǎn)物都是小分子單糖，能自由進(jìn)出細(xì)胞，所以細(xì)胞固定化技術(shù)是用來制作固定化GIase制劑的首選方法。

單位質(zhì)量的酶活力是衡量固定化酶制劑的主要指標(biāo)之一，單位質(zhì)量細(xì)胞含量越多，相應(yīng)的酶活力越高。針對(duì)吸附和包埋等方法所生產(chǎn)的酶制劑中載體含量比例高、單位質(zhì)量酶活低、生產(chǎn)占用設(shè)備體積大等問題，絮凝法固定制備的酶制劑能有效地解決該類問題[2-7]。同時(shí)，天然存在的絮凝劑——?dú)ぞ厶牵鳛橐环N堿性陽離子絮凝劑，無毒、無味、無污染，其親水性和生物相容性好，操作條件溫和，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有能與細(xì)胞表面基團(tuán)相作用的功能團(tuán)，是絮凝和回收蛋白質(zhì)的理想絮凝劑[8]，而具有雙功能基團(tuán)的交聯(lián)劑——戊二醛利用其羰基能同時(shí)與殼聚糖和酶分子上的氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)生成Schiff堿，將物理吸附和化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合，形成殼聚糖、酶分子和戊二醛分子間的多重交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，不但使酶分子有效固定在載體上，而且使酶制劑的穩(wěn)定性和耐壓強(qiáng)度大大提高[9-10]。

目前國內(nèi)市場(chǎng)所使用的固定化GIase制劑被諾維信公司壟斷，在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，一種來源于嗜熱菌Thermobifida fusca GIase的基因xylA在E. coli中被成功克隆表達(dá)，并對(duì)純化酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，以葡萄糖為底物該酶的米氏常數(shù)(Km)和催化常數(shù)(Kcat)值分別為190mmol/L和28s-1，70℃條件下的半衰期為15h，高的催化活力和良好的熱穩(wěn)定性使該酶成為改進(jìn)葡萄糖異構(gòu)化食品工業(yè)過程中具有巨大潛力的選擇。本實(shí)驗(yàn)擬采用殼聚糖絮凝加戊二醛交聯(lián)的固定辦法，對(duì)產(chǎn)Thermobifida fusca GIase的重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行固定化過程研究，以期獲得一種生產(chǎn)性能好、酶活回收率高、經(jīng)濟(jì)成本低的固定化酶制劑的方法，為實(shí)現(xiàn)我國固定化GIase制劑高效、低耗的工業(yè)化生產(chǎn)，提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株xylA/pT7-7/BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存和提供；高密度發(fā)酵液為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵提供(光密度OD600nm≈140，菌體干質(zhì)量為80～90g/L，pH7.2)。

殼聚糖(脫乙酰度≥98.0%)、硅藻土(食品級(jí)，60目)、25%戊二醛、冰醋酸、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、活性炭、二氧化硅 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

721型分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Hitachi himac CFl6RX高速離心機(jī) 日立工機(jī)株式會(huì)社；PHS-3C精密pH計(jì) 上海嘉鵬科技有限公司；JB90-D型強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī) 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；120軸式擠壓機(jī) 山東章丘市華祥機(jī)械廠。

1.3 殼聚糖絮凝

取250mL發(fā)酵液，添加硫酸鎂至Mg2+終濃度為5mmol/L，經(jīng)60℃熱處理30min后冷卻至25℃，在磁力攪拌器上，以800r/min轉(zhuǎn)速攪拌，同時(shí)把100mL用醋酸溶解的殼聚糖溶液緩慢流加到發(fā)酵液中，室溫條件下靜置10min待絮凝顆粒下沉。絮凝效果以酶活回收率來評(píng)定，依照1.6.1節(jié)中發(fā)酵液酶活力的測(cè)定方法測(cè)定酶活力，酶活回收率按式(1)計(jì)算。

1.3.1 pH值對(duì)絮凝效果的影響

調(diào)節(jié)殼聚糖中醋酸的含量，使其與發(fā)酵液按比例混合后溶液的最終pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。同時(shí)設(shè)定其他條件為殼聚糖終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2‰、溫度30℃。

1.3.2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)絮凝效果的影響

調(diào)節(jié)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與發(fā)酵液混合，使得混合后溶液中的殼聚糖的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01‰、0.05‰、0.10‰、0.15‰、0.20‰、0.25‰、0.30‰。同時(shí)設(shè)定其他條件為pH5.5、溫度30℃。

1.4 戊二醛交聯(lián)

棄去絮凝后的上清液，取絮凝物加入100mL一定濃度和pH值的戊二醛溶液，在一定溫度條件下，低速攪拌一定時(shí)間，經(jīng)布氏漏斗過濾后，用去離子水浸泡清洗過濾交聯(lián)產(chǎn)物2次，把濾餅用擠壓機(jī)擠壓成直徑1mm的顆粒，在35℃的烘箱中鼓風(fēng)烘至質(zhì)量恒定，得到交聯(lián)樣品；如果絮凝物未經(jīng)戊二醛交聯(lián)，直接過濾擠壓成顆粒后干燥，則為未交聯(lián)樣品。依照1.6.1節(jié)中固定化細(xì)胞酶制劑活力的測(cè)定方法測(cè)定等質(zhì)量交聯(lián)樣品和未交聯(lián)樣品的酶活力，然后測(cè)定交聯(lián)樣品在75℃處理1h之前和之后的酶活。交聯(lián)效果參照交聯(lián)后酶活保留率和熱處理后酶活保留率來確定，分別按式(2)、(3)計(jì)算。

1.4.1 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)交聯(lián)效果的影響

調(diào)節(jié)戊二醛溶液的體積分?jǐn)?shù)與絮凝物混合，使得混合后溶液中戊二醛的終體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。同時(shí)設(shè)定交聯(lián)溫度25℃、時(shí)間3h、pH7.0，攪拌速率100r/min進(jìn)行交聯(lián)。

1.4.2 交聯(lián)pH值對(duì)交聯(lián)效果的影響

用50mmol/L的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)戊二醛溶液的pH值與絮凝物混合，使得混合后溶液中的pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。同時(shí)設(shè)定交聯(lián)溫度25℃、時(shí)間3h、戊二醛體積分?jǐn)?shù)0.25%、攪拌速率100r/min進(jìn)行交聯(lián)。

1.5 硅藻土改性

在絮凝前添加一定量的硅藻土到發(fā)酵液中后，按1.3節(jié)殼聚糖絮凝效果操作方法繼續(xù)操作?？疾鞖ぞ厶侨芤褐泄柙逋敛煌砑恿?.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100mL對(duì)固定化細(xì)胞的耐壓強(qiáng)度和傳質(zhì)性能的影響。

1.6 固定化細(xì)胞特性

1.6.1 酶活力測(cè)定

酶活力(U)單位定義為：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中，每分鐘產(chǎn)生lμmol果糖所需的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位。

發(fā)酵液酶活力的測(cè)定：異構(gòu)化葡萄糖反應(yīng)體系反應(yīng)總體積2mL，體系中葡萄糖、MgSO4和磷酸鹽緩沖液(pH7.5)的濃度分別為300、5、100mmol/L，發(fā)酵液添加量為0.2mL，反應(yīng)在靜置狀態(tài)下、70℃水浴中進(jìn)行10min，然后在100℃水浴10min中止反應(yīng)，12000r/min離心5min后，取上清液適當(dāng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定果糖含量，確定反應(yīng)體系的總活力，發(fā)酵液的酶活力按式(4)計(jì)算。

固定化細(xì)胞酶制劑活力的測(cè)定：固定化細(xì)胞異構(gòu)化葡萄糖反應(yīng)體系總體積100mL，體系中葡萄糖、MgSO4和磷酸鹽緩沖液(pH7.5)的濃度分別為600、5、100mmol/L，固體酶制劑添加2.5g，固體酶制劑先在磷酸鹽緩沖液(pH7.5)浸泡1h，各成分混合前分別在70℃預(yù)熱，反應(yīng)在70℃、150r/min水浴搖床中進(jìn)行15min，12000r/min離心5min后，取上清液適當(dāng)稀釋后用HPLC測(cè)定果糖含量，確定反應(yīng)體系的總酶活力，固定化細(xì)胞酶制劑酶活力按式(5)計(jì)算。

1.6.2 糖含量測(cè)定

樣品稀釋一定倍數(shù)后用0.45μm微孔濾膜過濾后用HPLC法測(cè)定葡萄糖和果糖含量[11]。色譜條件為：Agilent1200 HPLC色譜儀；色譜柱：Aminex HPX-87H ion exclusion cloumn(7.8mm×300mm)；流動(dòng)相：0.5mmol/L H2SO4溶液；流速：1mL/min；Waters2410示差折光檢測(cè)器；柱溫：50℃；池溫(檢測(cè)器) 30℃；進(jìn)樣量：10μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

配制不同濃度(20～800mmol/L)的葡萄糖溶液，分別取lg固定化酶和1mL游離酶液，在70℃和pH7.5條件下反應(yīng)10min后迅速置于沸水浴中終止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得生成產(chǎn)物的濃度，求出酶反應(yīng)初速率。以反應(yīng)速率和底物濃度的雙倒數(shù)作圖，求得米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速率Vmax。直線回歸采用Kaleida Graph軟件分析[12]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6.4 耐壓強(qiáng)度測(cè)定

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23533—2009《固定化葡萄糖異構(gòu)酶制劑》，固定化酶用60℃蒸餾水浸沒，然后緩慢攪動(dòng)20h，再把樣品放在20N/cm2的壓強(qiáng)條件下擠壓3min，釋放壓力后樣品不成漿(或極少量成漿)仍硬，為合格。反之，為不合格。

1.6.5 操作穩(wěn)定性測(cè)定

參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23533—2009附錄A，在工作溫度(55～60℃)條件下恒速流加40%的葡萄糖底物溶液到反應(yīng)柱中進(jìn)行異構(gòu)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使初始產(chǎn)物中葡萄糖的轉(zhuǎn)化率在45%左右，間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定產(chǎn)物中的葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，計(jì)算殘留酶活力，確定操作穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對(duì)產(chǎn)酶細(xì)胞的絮凝

殼聚糖對(duì)產(chǎn)酶細(xì)胞的絮凝效果由絮凝后溶液中的蛋白殘留量決定，實(shí)際考察絮凝前后溶液中的酶活力以確定絮凝效果。絮凝效果與絮凝時(shí)的溫度、水流的紊動(dòng)程度、殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、絮凝pH值等因素相關(guān)。通常溫度越高，發(fā)酵液黏度越小，分子布朗運(yùn)動(dòng)越快，絮凝團(tuán)越易形成，但過高的溫度又會(huì)破壞絮凝團(tuán)形成[13]，本實(shí)驗(yàn)選擇30℃進(jìn)行操作。絮凝效果還與水流紊亂程度相關(guān)，在攪拌條件下，單位體積水體中顆粒碰撞的總次數(shù)會(huì)隨水流紊亂程度的增加而增大，絮凝團(tuán)直徑會(huì)隨水流紊亂程度的增加而減小[14]，由于攪拌的方式和設(shè)備形狀的不同，攪拌速率和方法應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定，本實(shí)驗(yàn)使用葉輪式電動(dòng)攪拌機(jī)，以產(chǎn)生的絮凝團(tuán)直徑小于1mm為標(biāo)準(zhǔn)確定攪拌速率，以利于后續(xù)過程中戊二醛能對(duì)絮凝團(tuán)進(jìn)行均勻交聯(lián)。確定以上條件后，對(duì)絮凝pH值和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行進(jìn)一步考察。

2.1.1 pH值對(duì)絮凝效果的影響

電荷吸附作用是殼聚糖絮凝蛋白質(zhì)的主要原因之一，在堿性和中性環(huán)境條件下，殼聚糖不被質(zhì)子化，不能中和帶負(fù)電的蛋白質(zhì)，無法絮凝菌體細(xì)胞，所以要在酸性條件下溶解殼聚糖，但如果溶液pH值過低則會(huì)導(dǎo)致目的蛋白失活，因此設(shè)定pH值考察范圍為4.5～6.5。由圖1可知，絮凝效果(酶活回收率)在pH5.0～5.5時(shí)最高，達(dá)到98%，考慮到低pH值對(duì)酶活力的影響，選取最適絮凝pH值為5.5。

圖 1 pH值對(duì)絮凝效果的影響Fig.1 Effect of pH on flocculation

2.1.2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)絮凝效果的影響

分子間的吸附是殼聚糖絮凝蛋白質(zhì)的另一主要原因，過低的殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)難以吸附足夠的蛋白質(zhì)，使吸附不充分，反之，當(dāng)殼聚糖投加過量時(shí)，則蛋白質(zhì)相對(duì)較少，殼聚糖聚合物伸展部分發(fā)生自身黏連，產(chǎn)生了包裹作用，吸附作用發(fā)揮不良?？紤]到高密度發(fā)酵液菌體蛋白含量很高，故設(shè)定殼聚糖溶液終質(zhì)量分?jǐn)?shù)考察范圍在0.01‰～0.3‰。由圖2可知，酶活回收率在殼聚糖溶液終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1‰～0.2‰時(shí)最高，考慮到生產(chǎn)成本和單位質(zhì)量的酶活力，選取殼聚糖溶液終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1‰。

圖 2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)絮凝效果的影響Fig.2 Effect of chitosan concentration on flocculation

2.2 戊二醛對(duì)絮凝物的交聯(lián)

固定化酶制劑的生產(chǎn)性能由單位質(zhì)量的酶活力和熱穩(wěn)定性共同決定，因此同時(shí)考察交聯(lián)后固定化酶的活力和熱穩(wěn)定性以確定交聯(lián)效果。交聯(lián)效果與交聯(lián)劑的體積分?jǐn)?shù)、pH值、時(shí)間和溫度等因素相關(guān)。

交聯(lián)反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，交聯(lián)反應(yīng)速率在一定溫度范圍內(nèi)會(huì)隨溫度上升而增大，但過于劇烈的交聯(lián)反應(yīng)一方面會(huì)降低酶活，另一方面會(huì)導(dǎo)致絮凝團(tuán)內(nèi)外交聯(lián)程度不均勻，所以選擇在室溫或更低溫度條件下交聯(lián)3h。在此基礎(chǔ)上，對(duì)戊二醛體積分?jǐn)?shù)和交聯(lián)pH值進(jìn)行進(jìn)一步考察。

2.2.1 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)交聯(lián)效果的影響

戊二醛是一種交聯(lián)劑，有2個(gè)醛基，可與蛋白質(zhì)或殼聚糖的游離氨基發(fā)生Schiff堿反應(yīng)生成亞胺鍵，使酶和殼聚糖交聯(lián)，從而增加凝膠機(jī)械強(qiáng)度和酶的穩(wěn)定性。戊二醛的體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化效果影響較大，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)過低時(shí)，酶分子不能被有效固定，酶穩(wěn)定性較低；當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，交聯(lián)反應(yīng)會(huì)深入到酶分子內(nèi)部，特別當(dāng)活性位點(diǎn)氨基酸受到交聯(lián)時(shí)，酶的催化活性將會(huì)受到影響[15]。將250mL發(fā)酵液得到的絮凝物用250mL的戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，設(shè)定戊二醛終體積分?jǐn)?shù)的考察范圍為0%～2.5%。由圖3可知，隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增加，交聯(lián)樣品的活力迅速下降，而交聯(lián)樣品的熱穩(wěn)定性僅小幅增加，當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)低于0.25%時(shí)，相對(duì)于未交聯(lián)的樣品(對(duì)照樣品酶活力為100%)，交聯(lián)樣品的酶活保留率在80%以上，綜合考慮，選擇0.25%為戊二醛最適交聯(lián)體積分?jǐn)?shù)。

圖 3 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化效果的影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on immobilization

2.2.2 交聯(lián)pH值對(duì)交聯(lián)效果的影響

當(dāng)戊二醛與酶分子形成共價(jià)鍵時(shí)，特定pH值條件下酶分子的狀態(tài)就會(huì)被不可逆地固定，所以通常應(yīng)在酶的最適pH值條件下固定酶分子，本研究中GIase的最適pH值為10，在pH10條件下，殼聚糖分子難以溶解，亞胺鍵難以形成，導(dǎo)致其與戊二醛的交聯(lián)程度低。因此實(shí)驗(yàn)設(shè)定交聯(lián)時(shí)pH值的考察范圍為5.5～9.0。由圖4可知，在不同pH值條件下交聯(lián)制備的固定化酶，其交聯(lián)后的酶活保留率在pH8.0時(shí)最高，而75℃熱處理1h后的酶活保留率在pH6.5～8.5范圍內(nèi)差別很小，但考慮到酸性條件下戊二醛與殼聚糖的交聯(lián)程度更高，會(huì)使固定化酶的耐壓強(qiáng)度更高，因此選取pH6.5為最適交聯(lián)pH值。

圖 4 pH值對(duì)固定化效果的影響Fig.4 Effect of pH on immobilization

2.3 硅藻土改性研究

工業(yè)生產(chǎn)要求固定化酶制劑顆粒既要有較高的耐壓強(qiáng)度，又要有較好的空隙以利于底物和產(chǎn)物進(jìn)出，僅通過殼聚糖絮凝和戊二醛交聯(lián)所制備的固定化GIase制劑顆粒干燥后質(zhì)地十分致密，傳質(zhì)性能差，不利于異構(gòu)反應(yīng)進(jìn)行。硅藻土粉末不僅具有吸附和抗溶脹效果，還有塑形、助濾和改善固定化顆粒傳質(zhì)特性的作用，并且價(jià)格相對(duì)二氧化硅、活性炭等較低，經(jīng)綜合考慮確定硅藻土作為添加物對(duì)固定化顆粒進(jìn)行改性?？疾彀l(fā)酵液中硅藻土不同添加量0%～1.0%(不添加硅藻土為對(duì)照組)對(duì)固定化細(xì)胞的耐壓強(qiáng)度和傳質(zhì)性能影響。由表1可知，在硅藻土添加量為0.4%～0.6%時(shí)，固定化GIase制劑顆粒的耐壓強(qiáng)度既能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23533—2009)要求又有較好的傳質(zhì)性，表現(xiàn)為等量產(chǎn)酶細(xì)胞制備的酶制劑的相對(duì)活力較高。綜合考慮固定化GIase制劑顆粒單位質(zhì)量的酶活力、耐壓強(qiáng)度和傳質(zhì)性能等因素，選取硅藻土添加量為0.6%。

表 1 硅藻土添加量對(duì)固定化產(chǎn)物的耐壓強(qiáng)度和傳質(zhì)性能影響Table 1 Effect of diatomite addition on pressure strength and mass transfer performance of immobilized products

2.4 固定化酶的性質(zhì)

2.4.1 最適pH值

殼聚糖為陽離子絮凝劑，會(huì)在其表面結(jié)合大量OH－，形成弱堿性的微環(huán)境，造成H+和OH－在載體表面和溶液中的分配不同，使酶促反應(yīng)的最適pH值向酸性方向偏移[16]，由圖5可知，固定化酶的最適pH值相對(duì)游離酶由pH10降低至pH9，最適pH值的降低可減少異構(gòu)反應(yīng)過程中副產(chǎn)物和色素的形成[17]，符合生產(chǎn)需要。同時(shí)，固定化酶在pH5～11的較寬范圍內(nèi)相對(duì)酶活力較高，在pH7.5時(shí)為其最高酶活力的90%左右，為減少異構(gòu)反應(yīng)過程中副產(chǎn)物和色素的產(chǎn)量，所以仍然選擇在pH7.5條件下進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)反應(yīng)。

圖 5 固定化酶和游離酶的最適pH值Fig.5 Optimal pH of immobilized enzyme and free enzyme

2.4.2 最適溫度

圖 6 固定化酶和游離酶的最適溫度Fig.6 Optimal temperature of immobilized enzyme and free enzyme

固定化后，GIase分子表面氨基通過戊二醛的醛基與自身或與殼聚糖分子表面氨基形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，抗熱變性作用能力增加[18]。由圖6可知，固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度均為80℃，與游離酶相比，固定化酶在40～95℃范圍內(nèi)的相對(duì)酶活力較高，在60℃時(shí)仍保留最大酶活力的75%。由于高溫條件下酮糖會(huì)發(fā)生分解并加快美拉德反應(yīng)，并且固定化酶失活加快[17]，所以仍然選擇在55～60℃條件下進(jìn)行葡萄糖異構(gòu)反應(yīng)。

2.4.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

以20～800mmol/L葡萄糖為底物，分別測(cè)定顆粒狀固定化酶與游離酶的酶活力，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得Km。固定化酶和游離酶的表觀Km分別為230、190mmol/L。與游離酶相比，固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km增大，這與Demirel[19]報(bào)道的包埋鍵合所構(gòu)建的固定化GIase相對(duì)游離態(tài)GIase的Km值的變化相反，他們認(rèn)為底物和載體間的靜電引力造成Km值減小。這其中的可能原因一方面是交聯(lián)反應(yīng)對(duì)酶分子構(gòu)象的影響，另一方面也可能是固定化顆粒的空間阻礙和擴(kuò)散限制的影響。

圖 7 固定化酶與游離酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Double reciprocal plots for reaction curve of immobilized GIase and free GIase

2.4.4 操作穩(wěn)定性結(jié)果

在60℃條件下恒速流加45%的葡萄糖底物溶液到反應(yīng)柱中進(jìn)行異構(gòu)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，確定操作穩(wěn)定性。由圖8可知，固定化酶初始酶活力為356U/g。連續(xù)操作30d，殘留酶活力大于70%。參照酶失活一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[20]：[E]=[E0]exp(kdt)，t1/2=ln2/kd。

式中：t1/2為半衰期/d；kd為衰減常數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間/d；[E0]為初始酶活力/U；[E]為中間過程酶活力/U。

對(duì)圖中的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得到固定化酶的失活方程為ln([E]/[E0])=－0.0112t，則kd=0.01129、t1/2=ln2/kd=61d，即半衰期為61d，能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求。

圖 8 固定化酶制劑的操作穩(wěn)定性Fig.8 Operation stability of immobilized enzyme preparation

3 結(jié) 論

本研究確定了最佳殼聚糖絮凝條件、最佳戊二醛交聯(lián)條件和最佳的添加物種類和比例及固定化操作方法。所制得的固定化GIase與游離的GIase相比最適溫度不變、最適pH值降低；其單位質(zhì)量的活力遠(yuǎn)優(yōu)于基于凝膠包埋和離子吸附等方法制備的固定化GIase制劑[21-28]。

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