輔助菌共培養(yǎng)條件對(duì)橙色粘球菌次生代謝產(chǎn)物的影響

黃艷 胡建偉 朱紅惠

（1.塔里木大學(xué) 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；2.廣東省微生物研究所 廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070）

粘細(xì)菌屬于δ-變形桿菌綱（Deltaproteobacteria），粘細(xì)菌目（Myxococcales），包括3個(gè)亞目，7個(gè)科，21個(gè)屬［1-3］，具有復(fù)雜的生活發(fā)育史，被認(rèn)為是高等原核生物［4，5］，僅次于放線菌之后又一具有開發(fā)價(jià)值的藥源微生物［6-9］。然而粘細(xì)菌分離純化困難，生長緩慢，次生代謝產(chǎn)物得率低［10］，嚴(yán)重制約了粘細(xì)菌研究工作的深入開展。有研究表明，與其它類群細(xì)菌共培養(yǎng)，對(duì)粘細(xì)菌的生長更有利［11］，這些細(xì)菌菌株被稱為輔助菌（helper bacteria）。Jacobi等［12］證實(shí)大部分軟骨霉?fàn)罹鷮伲–hondromyces）粘細(xì)菌的生長都依賴于鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）的一種圓形細(xì)菌，只有后者存在時(shí)，前者才能正常生長繁殖。然而輔助菌共培養(yǎng)對(duì)粘細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物有何影響，目前仍不清楚。

本課題組在新疆鹽堿地環(huán)境中分離得到一株橙色粘球菌（Myxococcus fulvus），編號(hào)為8.5［13］，同時(shí)篩選到2株輔助菌，分別為42號(hào)和43號(hào)細(xì)菌，它們能被橙色粘球菌8.5捕食。本研究通過在液態(tài)培養(yǎng)方式下加入輔助菌與粘細(xì)菌共培養(yǎng)，研究輔助菌對(duì)橙色粘球菌次生代謝產(chǎn)物的影響，以期提高橙色粘球菌的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

橙色粘球菌（M. fulvus）8.5菌株，微枝形桿菌屬（Microvirga sp.）細(xì)菌編號(hào)為42號(hào)，無色桿菌屬（Achromobacter sp.）細(xì)菌編號(hào)為43號(hào)輔助細(xì)菌均由本課題組分離鑒定得到，保存于廣東省微生物菌種保藏中心。

薄層層析采用煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所的TLC高效薄層層析板（GF254）；離心機(jī)為Beckman的AvantiJ-20xp型離心機(jī)；分析色譜柱為Agilent C18柱（250 cm×4.6 mm）；高效液相色譜儀為Agilent 1260；色譜純甲醇和乙腈為Fisher Scientific公司生產(chǎn)，其他有機(jī)試劑均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 橙色粘球菌最佳生長培養(yǎng)基的選擇 選擇CY、Ht、Ht1和VY-2 四種培養(yǎng)基。將橙色粘球菌8.5分別接種于上述4種液體及固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)于30℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行，固體培養(yǎng)于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。細(xì)菌接種后，每天觀察、記錄菌體的生長情況，選擇最適宜其生長的培養(yǎng)基。

CY、Ht、Ht1和VY-2四種培養(yǎng)基的pH約為7.2，主要配方（以下為1 L培養(yǎng)基的配方，固態(tài)培養(yǎng)基加入1.5%-2%的瓊脂）如下。

CY培養(yǎng)基：酪蛋白胨0.3 g；酵母浸出粉0.1 g；CaCl2·2H2O 0.1 g。

Ht培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1 g；氯化鈣0.01 g；硫酸鎂0.03 g；硫酸亞鐵0.001 g；硝酸鈉0.25 g；可溶性淀粉2%。

Ht1培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀0.1 g；氯化鈣0.01 g；硫酸鎂0.03 g；硫酸亞鐵0.001 g；硝酸鈉0.25 g。

VY-2培養(yǎng)基：安琪活性干酵母0.5 g；維生素B120.05 mg；氯化鈣0.1 g。

1.2.2 液態(tài)發(fā)酵時(shí)輔助菌最佳加入時(shí)間段的試驗(yàn) 選擇VY-2培養(yǎng)基進(jìn)行橙色粘球菌8.5與42號(hào)、43號(hào)輔助菌的共培養(yǎng)試驗(yàn)。將VY-2液體培養(yǎng)基分裝為25 mL/瓶的100 mL三角瓶中，共50瓶。將橙色粘球菌8.5適量接種于各瓶液體培養(yǎng)基中，于30℃，150 r/min震蕩培養(yǎng)7 d。將42號(hào)、43號(hào)輔助菌培養(yǎng)至12 h時(shí)，每隔12 h分別接種于上述生長狀態(tài)良好的橙色粘球菌8.5的VY-2培養(yǎng)基中，接入時(shí)間分別為橙色粘球菌生長至：0、12、24、48、60、72、84和96 h（0 h即為粘細(xì)菌與輔助菌同時(shí)接入，12 h即為粘細(xì)菌生長12 h后接入輔助菌，依次類推），接種量為0.1 mL，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行，每天觀察菌體生長情況，空白對(duì)照（CK）為未接入輔助菌的橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)。同樣，也將42號(hào)、43號(hào)細(xì)菌進(jìn)行相同方法的單獨(dú)培養(yǎng)。

培養(yǎng)7 d，收集發(fā)酵液，用低溫冷凍離心機(jī)4℃，6 000 r/min離心15 min后將菌體和上清分開收集；收集菌體，離心后將離心管倒置數(shù)分鐘后，至無水分流出，用分析天平稱量，得到濕菌體得率；上清用等體積的乙酸乙酯充分萃取3次，乙酸乙酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)、濃縮、干燥后，得到粗提物，空白對(duì)照及42號(hào)、43號(hào)菌的處理與之相同，得到粗提物的得率。

1.2.3 單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)粗提物的HPLC分析 將最佳時(shí)間段加入輔助菌共培養(yǎng)后的發(fā)酵產(chǎn)物（乙酸乙酯相），8.5與42號(hào)、43號(hào)細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物（乙酸乙酯相）取等量粗提物經(jīng)甲醇溶解后，用微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，方法為：流動(dòng)相溶劑為：A為0.2%的乙酸、水，B為甲醇，流速為1 μL/min，檢測波長為214 nm。得到共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)代謝產(chǎn)物的變化情況分析圖譜。

2 結(jié)果

2.1 橙色粘球菌8.5最佳生長的培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)時(shí)，橙色粘球菌8.5可在Ht上生長，Ht1上未能生長，在CY和VY-2培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)較好。在相同生長時(shí)間中，橙色粘球菌8.5在CY培養(yǎng)基中的擴(kuò)展菌落圈更均勻，但菌層??；8.5在VY-2培養(yǎng)基中的擴(kuò)展菌落圈小，但中間菌落擴(kuò)展層厚，邊緣較?。▓D1）。

圖1 橙色粘球菌8.5在CY培養(yǎng)基（a）和VY-2培養(yǎng)基（b）的生長第3天比較

如表1所示，在液體培養(yǎng)時(shí)，橙色粘球菌8.5在Ht和Ht1培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)不佳，說明僅有淀粉和無機(jī)鹽的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基不足以滿足該橙色粘球菌8.5的生長。8.5在CY和VY-2培養(yǎng)基中生長情況良好。液態(tài)發(fā)酵時(shí)，測得乙酸乙酯相的粗提物得率分別為0.32 g/L和0.28 g/L。但考慮到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)VY-2較CY成本更低，因而，液態(tài)發(fā)酵時(shí)加入輔助菌最佳時(shí)間段的試驗(yàn)選用VY-2培養(yǎng)基。

2.2 液態(tài)發(fā)酵時(shí)加入輔助菌的最佳時(shí)間段

表1 橙色粘球菌8.5在不同生長培養(yǎng)基中的生長狀況比較

圖2 42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)時(shí)加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)橙色粘球菌生長和次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

圖2-A顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基加入粘細(xì)菌8.5發(fā)酵7 d得到的粗提物浸膏得率為0.24 g/L。0-96 h不同時(shí)間點(diǎn)加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得粗提物得率均有所增加。增幅為：0.05-0.40 g/L。其中，72 h和84 h時(shí)加入42號(hào)輔助菌，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大，為0.64 g/L；圖2-B顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基接入橙色粘球菌8.5發(fā)酵相同時(shí)間得到的濕菌體得率為14.88 g/L。42號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，除12 h加入輔助菌共培養(yǎng)的濕菌體得率低于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濕菌體得率外，其他時(shí)間加入輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率均有提高，增幅為：0.28-9.68 g/L。72 h加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率最高，為24.55 g/L。

圖3 43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)加入時(shí)間點(diǎn)對(duì)橙色粘球菌生長和次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

圖3-A顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基加入橙色粘球菌8.5發(fā)酵7 d得到的粗提物浸膏得率為0.24 g/L。0-96 h不同時(shí)間點(diǎn)加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得粗提物得率均有所增加。增幅為：0-0.45 g/L。其中，橙色粘球菌8.5與43號(hào)輔助菌同時(shí)接入共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大為0.69 g/L；圖3-B顯示，空白對(duì)照（CK）：只在VY-2培養(yǎng)基接入橙色粘球菌8.5發(fā)酵相同時(shí)間得到的濕菌體得率為14.875 g/L。43號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，濕菌體得率均有提高，增幅為：2.28-10.73 g/L。96 h加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)使得濕菌體得率最高，為25.60 g/L。

對(duì)加入輔助菌共培養(yǎng)時(shí)，輔助菌自身能夠被橙色粘球菌8.5所捕食。對(duì)濕菌體得率及乙酸乙酯萃取后粗提物的得率進(jìn)行分析，結(jié)果表明，加入42號(hào)及43號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)濕菌體得率及粗提物得率大體上均有所增加。其中，42號(hào)輔助菌72 h和84 h時(shí)加入共培養(yǎng)，發(fā)酵粗提物浸膏的得率最大為0.64 g/L；72 h加入共培養(yǎng)，濕菌體得率最高，為24.55 g/L；43號(hào)輔助細(xì)菌與橙色粘球菌8.5同時(shí)接入共培養(yǎng)時(shí)，粗提物得率最高為0.69 g/L，96 h加入共培養(yǎng)，濕菌體得率最高，為25.60 g/L。

2.3 不同輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)的粗提物成分特征

圖4-A顯示，42號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)的出峰情況相較于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，基本一致；圖4-B顯示，43號(hào)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)時(shí)，相較于橙色粘球菌8.5單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)生的部分峰減少，如17.341 min，28.882 min，29.995 min，部分峰增多，如4.389 min。

綜合圖4-A、B可見，43號(hào)輔助菌相較于42號(hào)輔助細(xì)菌出峰更少，表明兩株細(xì)菌的代謝產(chǎn)物生成情況可能并不豐富。在保證粘細(xì)菌原有次生代謝產(chǎn)物基本一致時(shí)，應(yīng)該選擇42號(hào)輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)為最佳輔助細(xì)菌。如若考慮得到4.389 min的代謝產(chǎn)物，則可選擇43號(hào)菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)。

3 討論

野生粘細(xì)菌的次級(jí)代謝物產(chǎn)量很低，給活性產(chǎn)物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定等帶來很大困難［10］。很多研究者通過不同方法提高次級(jí)代謝產(chǎn)物得率：例如王寧等［14］通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，劉迎等［15］通過加入次級(jí)代謝產(chǎn)物的粗提物作為誘導(dǎo)物均達(dá)到了提高次生代謝產(chǎn)物得率的效果。Margarita等［16］的研究發(fā)現(xiàn)輔助菌的加入能夠縮短布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）的休眠時(shí)間，因此，本研究采用輔助菌與橙色粘球菌8.5共同培養(yǎng)的方法，嘗試解決粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物得率低的問題。研究發(fā)現(xiàn)，在粘細(xì)菌分泌次生代謝產(chǎn)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)輔助菌的加入，能夠促進(jìn)橙色粘球菌的生長，并可被橙色粘球菌所捕食，而不同時(shí)間加入輔助菌的作用效果不同，在最佳時(shí)間加入輔助菌會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物的得率產(chǎn)生更好的影響。對(duì)濕菌體得率而言，橙色粘球菌8.5培養(yǎng)至72 h加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳，培養(yǎng)至96 h加入43號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳；對(duì)粗提物得率而言，橙色粘球菌8.5培養(yǎng)至72 h和84 h時(shí)加入42號(hào)輔助菌共培養(yǎng)最佳，橙色粘球菌8.5與43號(hào)輔助菌同時(shí)接入共培養(yǎng)最佳。黃兵［17］的研究證實(shí)共培養(yǎng)體系的成功建立關(guān)鍵在于兩株菌的接種時(shí)間及接種順序等，本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

圖4 不同輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)時(shí)HPLC分析圖譜

兩株輔助菌與橙色粘球菌8.5共培養(yǎng)后的次生代謝產(chǎn)物成分有所不同，42號(hào)輔助菌的加入基本不改變橙色粘球菌原有的次生代謝組分，43號(hào)輔助菌的加入能夠改變橙色粘球菌的部分次生代謝組分。郭鵬飛等［18］的研究表明海綿來源的微生物共培養(yǎng)可以產(chǎn)生新的活性代謝產(chǎn)物。這表明兩株輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)的作用機(jī)制不同。對(duì)粘細(xì)菌在加入輔助菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物組分不同的原因作以下幾點(diǎn)推測：（1）捕食行為引起次生代謝產(chǎn)物的變化，輔助菌被粘細(xì)菌捕食后，開啟了不同于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)新的代謝方式；（2）兩株菌株協(xié)同作用的結(jié)果，自然環(huán)境中微生物的互作現(xiàn)象普遍［19］，有研究表明，巨大芽孢桿菌胞外液能促進(jìn)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸［20］。本試驗(yàn)可能由于共培養(yǎng)的微生物在生長過程中各自產(chǎn)生的酶類相互協(xié)同作用將同一底物轉(zhuǎn)化為另一物質(zhì)；（3）沉默基因的激活，Hopwood［22］在1980年初提出通過菌株或種間自然接合等方法可以激活某些沉默的抗生素相關(guān)基因，從而獲取新抗生素和新活性物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究采用輔助菌與橙色粘球菌共培養(yǎng)方式研究對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，加入的輔助菌能夠被粘細(xì)菌捕食。發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后能夠總體上增加橙色粘球菌的生物量及次生代謝產(chǎn)物得率；42號(hào)輔助菌的加入基本不改變橙色粘球菌原有的次生代謝組分，43號(hào)輔助菌的加入能夠改變橙色粘球菌的部分次生代謝組分。但試驗(yàn)仍存在缺陷，未能找到使橙色粘球菌代謝產(chǎn)物形成更為豐富的輔助菌。篩選已有粘細(xì)菌的輔助菌株，進(jìn)行與粘細(xì)菌共培養(yǎng)研究，將有利于促進(jìn)粘細(xì)菌資源的開發(fā)與利用。

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