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    天然黃酮蘆丁的化學(xué)改性及抑菌作用

    2013-12-23 04:08:44郭艷華許國權(quán)李艾華張玉敏
    關(guān)鍵詞:蘆丁金黃色葡萄球菌

    郭艷華,許國權(quán),李艾華,張玉敏

    (江漢大學(xué) a.化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院; b.生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430056)

    蘆?。≧utin)屬黃酮類化合物,為天然產(chǎn)物的有效成分,毒性低,具有廣泛的生物活性,臨床上主要用于防治腦出血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜、急性出血性腎炎、慢性支氣管炎、鎮(zhèn)痛、抗輻射和抗疲勞,且有抗氧化和抗菌作用等[1]。近年來,國內(nèi)外文獻還報道蘆丁具有抗癌作用[2]。蘆丁分子中同時含有4-羰基5-羥基和鄰二酚羥基,強配位氧原子與合適的空間構(gòu)型可與多種金屬離子生成配位數(shù)不同的配合物,將這種具有特定生理活性的蘆丁與金屬離子形成配合物,既增強了配體的生物活性又降低了其毒性。研究表明,有些蘆丁過渡金屬配合物具有明顯的生物活性,有些藥理作用顯著,有些已證明具有抗菌性和抗腫瘤活性。因此,蘆丁的改性產(chǎn)物成為國內(nèi)外近些年來研究的熱點,特別是對于稀土蘆丁配合物的生物活性研究較多[3-4],而對第一過渡系金屬蘆丁配合物的生物活性極少報道,且一些文獻的報道都是在不同的條件下研究的個別改性產(chǎn)物,無系統(tǒng)性研究,且研究的結(jié)果也有較大差別[5-8]。至今,國內(nèi)外對蘆丁與第一過渡系生命元素形成的配合物在同等條件下的抗菌活性的比較研究未見報道。本課題比較研究了第一過渡系生命元素對蘆丁改性產(chǎn)物配合物的抑菌活性,對開拓蘆丁改性配合物在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用具有實際意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    蘆丁,氯化鈉,乙酸鉻,乙酸錳,乙酸鐵,乙酸鈷,乙酸鎳,乙酸銅,乙酸鋅,無水乙醇,甲醇,二甲基亞砜(DMSO),三氯乙酸,乙酸乙酯,三羥甲基氨基甲烷(Tris),均屬分析純。

    牛肉膏,蛋白胨,瓊脂均屬生化試劑。

    供試菌種:大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草桿菌(江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室提供)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    生化培養(yǎng)箱(國華儀器),無菌工作臺(蘇凈集團安泰公司制造),立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。721 分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),UV-2401 紫外可見分光光度計(日本島津),RE-S2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),DF110 型電子分析天平(中國輕工業(yè)機械總公司常孰衡器公司),紅外光譜儀-Tensor 27(德國bruker 公司),電熱真空干燥箱(海申光儀器儀表有限公司),HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司),JJ-1 型定時電動攪拌器(江蘇金壇中大儀器廠)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的制備 在探討出來的最佳合成條件(溫度,pH,反應(yīng)時間)下制備第一過渡系生命元素的蘆丁配合物。稱取一定量的蘆丁,溶于一定量體積的無水乙醇,電磁攪拌;待大部分配體溶解后,滴加氨水和乙醇的溶液,調(diào)節(jié)至合適的pH;邊攪拌邊加入溶有一定量的過渡金屬鹽的無水乙醇溶液,并在室溫下攪拌一定時間,溶液中有沉淀生成,停止反應(yīng),離心分離,用無水乙醇和蒸餾水洗滌沉淀,真空干燥后得到有色固體樣品,經(jīng)結(jié)構(gòu)表征得到①Ru-Cr;②Ru-Mn;③Ru-Fe;④Ru-Co;⑤Ru-Ni;⑥Ru-Cu;⑦Ru-Zn 等改性配合物(配合物合成的最佳條件探討及其表征本課題組將另行報道)。測定改性產(chǎn)物配合物與蘆丁的溶解性。

    1.3.2 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的抑菌作用比較 (1)培養(yǎng)皿的制備[9]。稱取5. 0 gNaCl,10. 0 g 蛋白胨,3. 0 g 牛肉膏于1 000 mL 燒杯中,加入800 mL 的蒸餾水,加熱攪拌使其溶解,待充分溶解后,加入15 g 瓊脂粉,加入200 mL 蒸餾水,用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7. 5,煮沸兩次后,趁熱轉(zhuǎn)移至洗凈的培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)皿中液體冷卻凝固后,將培養(yǎng)皿置于壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min。滅菌完畢后,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),若無菌生長,即可放入冰箱待用。

    (2)抑菌實驗方法。以DMSO 為溶劑溶解一定量的配合物,用無菌水稀釋成10 mg/mL 濃度的溶液,采用同樣的方法制成相同濃度的蘆丁和金屬醋酸鹽溶液,供抑菌實驗。用濾紙片法測定蘆丁配合物、蘆丁及過渡金屬醋酸鹽在相同濃度下的抑菌效果,以抑菌圈直徑作為評價標準[9]。打開無菌工作臺的紫外滅菌燈滅菌20 min,然后用無菌水配置菌液,用無菌吸管吸取1 mL 的無菌水,用無菌鐵圈蘸取不同菌種,在無菌水中攪拌,重復(fù)之前的操作一次。吸取200 μL 剛配好的大腸埃希菌菌液加到制備好的培養(yǎng)皿平板中,用無菌三角涂棒涂布均勻,將已涂布好的平板底皿做上記號,每等份內(nèi)標明一種溶液的編號,用無菌鑷子將已滅菌的小圓濾紙片(D7 mm)分別浸入裝有不同物質(zhì)配制的不同濃度溶液于小瓶中,每一區(qū)域貼3 片,再將上述貼好濾紙片的含菌平板倒置放入恒溫箱中培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h 后,用游標卡尺測定其抑菌圈直徑。分別比較不同樣品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草桿菌的抑菌活性。實驗結(jié)果見表2。

    1.3.3 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物濃度變化對抑菌作用的影響 用DMSO 和無菌水為溶劑配制濃度為30、10、1、0.5 mg/mL 配合物的溶液,按1.3.2 的方法測定蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物濃度變化對抑菌作用的影響,測定①~⑧樣品(見2.2),供試菌種選用樣品對其抑菌作用相對較強的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌。

    1.3.4 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物抑菌活性的穩(wěn)定性研究 取濃度為10 mg/mL 配合物的溶液,進行如下幾種方法處理:分別置于不同的溫度(20、40、60、80、100、120 ℃)條件下;將樣品調(diào)制成不同的pH(2、4、6、8、10)的溶液。根據(jù)1.3.2 的方法研究蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物的抑菌作用,以抑菌圈直徑為評價指標,測定蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性[10],供試菌種選用樣品對其抑菌作用相對更強的金黃色葡萄球菌。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的溶解性測定結(jié)果

    第一過渡系生命元素對蘆丁化學(xué)改性后配合物的溶解性測定結(jié)果見表1。

    表1 配合物和蘆丁溶解性測定結(jié)果

    由表1 可知,配合物和蘆丁能溶于部分有機溶劑,但是溶解度較低。配合物和蘆丁在DMSO中的溶解效果明顯好于實驗中的其他溶劑,而且比較發(fā)現(xiàn)蘆丁在生成配合物后水溶性明顯增強,這預(yù)示蘆丁的改性產(chǎn)物提高了其生物利用度。

    2.2 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的抑菌效果比較

    按1.3.1 和1.3.2 的方法測定,并將樣品編號為:①Ru-Cr;②Ru-Mn;③Ru-Fe;④Ru-Co;⑤Ru-Ni;⑥Ru-Cu;⑦Ru-Zn;⑧Ru;⑨Cu(Ac)2;⑩R(Ac)3(R=Cr,F(xiàn)e);11 Y(Ac)2(Y= Mn,Co,Ni,Zn)。供試樣品濃度均為10 mg/mL,圓濾紙片的直徑為6 mm,在37 ℃經(jīng)24 h 培養(yǎng)后,用游標卡尺測定其抑菌圈直徑,數(shù)據(jù)列于表2。

    表2 不同蘆丁配合物與蘆丁的抑菌效果比較

    根據(jù)抑菌圈大小可以初步確定物質(zhì)的抑菌能力大小,抑菌圈直徑越大表明抑菌活性越高[11]。

    由表2 數(shù)據(jù)分析可知:蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的抑菌效果強于蘆丁和金屬醋酸鹽,金屬醋酸鹽中除了醋酸銅在較高濃度下有很弱的抑菌活性外,其他幾種金屬醋酸鹽在測定的幾種濃度下沒有發(fā)現(xiàn)其抑菌作用,而同樣在此很低的濃度下,所得到蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物仍然有明顯的抑菌作用;編號①~⑦這7 種配合物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌性能,但系列改性配合物對大腸埃希菌的抑菌效果差別不大,對枯草桿菌的抑菌效果只達到中等敏感程度,對啤酒酵母的抑菌作用與蘆丁接近,說明本文所報道的這7 種配合物對不同菌種抗菌差異較大,而具有選擇性抗茵性能。而且蘆丁及其配合物抑制4 種細菌的能力強弱順序相同,比較抑菌強弱得到:Ru-Cu>Ru-Zn>Ru-Co>Ru-Ni>Ru-Mn>Ru-Cr>Ru-Fe>Ru>Cu(Ac);蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好,原因是由于與細胞磷脂和肽鏈上的羧基有較強的親和力,能穩(wěn)定在細胞膜及溶酶體膜上,從而抑制溶體酶釋放炎癥物質(zhì),一方面可以與菌的轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)中的磷?;I合,抑制了其核酸酶的活性及功能,從而使細菌的生長受到抑制;另一方面,由于形成配合物后,配合物的分子量和共軛效應(yīng)都增強,脂溶性增強,對細胞膜的穿透或破壞能力增強,使生物體生長和代謝需要的關(guān)鍵成分流失,導(dǎo)致生物體不能完成正常的運轉(zhuǎn)[12]。

    2.3 不同濃度蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物的抑菌作用

    按1.3.3 的方法實驗,其結(jié)果見表3。蘆丁的7 種改性產(chǎn)物配合物的抑菌作用,在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度的增大而增強,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。在4 種測定的濃度下,蘆丁的改性產(chǎn)物配合物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用始終強于大腸埃希菌,而抑菌作用的強弱一致,其強弱為:Ru-Cu>Ru-Zn>Ru-Co>Ru-Ni>Ru-Mn>Ru-Cr>Ru-Fe>Ru。在濃度增加過程中,蘆丁的改性產(chǎn)物配合物抑菌作用增加的幅度始終大于蘆丁。在濃度很低,為0. 5 mg/mL 時,蘆丁的改性產(chǎn)物配合物對金黃色葡萄球菌仍有較強的抑菌作用,但對大腸埃希菌幾乎沒有抑菌作用,而蘆丁已經(jīng)沒有抑菌作用。

    表3 不同濃度蘆丁配合物的抑菌效果比較

    2.4 蘆丁第一過渡系生命元素改性產(chǎn)物配合物抑菌活性的穩(wěn)定性分析

    2.4.1 溫度對抑菌效果的影響 按1.3.4 的實驗方法測得的溫度對抑菌效果影響的實驗結(jié)果見圖1。由圖1 可知,隨著處理溫度的升高,蘆丁的改性產(chǎn)物配合物抑制金黃色葡萄球菌的抑菌活性表現(xiàn)為穩(wěn)定性較好,抑菌效果有所升高,除Ru-Ni、Ru-Cr 變化幅度相對稍大外,其他都變化不大,120 ℃處理后仍然具有較好的抑菌作用,而蘆丁在溫度小于60 ℃抑菌效果變化平穩(wěn),但大于60 ℃后,對金黃色葡萄球菌的抑菌作用逐漸下降,120 ℃處理后無明顯抑菌作用。總體上隨著溫度升高蘆丁的改性產(chǎn)物配合物對金黃色葡萄球菌的抑制作用略有增強,且抑菌圈直徑均大于6 mm。 其抑菌強度規(guī)律:Ru-Cu>Ru-Zn>Ru-Co>Ru-Ni>Ru-Mn>Ru-Cr>Ru-Fe>Ru。

    圖1 溫度對抑菌效果的影響

    2.4.2 pH 對抑菌效果的影響 按1.3.4 的實驗方法測得的pH 對抑菌效果影響的實驗結(jié)果見圖2。由圖2 可知,在pH 為4~8 范圍內(nèi),蘆丁的改性產(chǎn)物配合物抑制金黃色葡萄球菌的抑菌活性表現(xiàn)為穩(wěn)定性較好,且抑菌效果也好,在pH 為6 時對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好,而在pH 大于8 以后,蘆丁配合物抑菌作用逐漸下降,到pH 為10時,下降幅度增大。而蘆丁在pH 大于6 以后對金黃色葡萄球菌的抑菌效果下降幅度比配合物大。在不同pH 值下,抑菌圈直徑均大于6 mm。其抑菌強度規(guī)律:Ru-Cu>Ru-Zn>Ru-Co>Ru-Ni>Ru-Mn>Ru-Cr>Ru-Fe>Ru。綜合來看,蘆丁的改性產(chǎn)物配合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性均在酸性到中性條件下更穩(wěn)定,而蘆丁對金黃色葡萄球菌的抑菌活性在酸性條件下更穩(wěn)定。

    圖2 pH 值對抑菌效果的影響

    3 結(jié)論

    本次研究結(jié)果表明,第一過渡系生命元素對蘆丁進行化學(xué)改性形成配合物后,這一系列的蘆丁配合物比蘆丁具有更強的抑菌活性,對4 種菌種的抑菌活性大小為:金黃色葡萄球菌>大腸埃希菌>枯草桿菌>啤酒酵母;蘆丁配合物抑菌活性的相對大小為:Ru-Cu>Ru-Zn>Ru-Co>Ru-Ni>Ru-Mn>Ru-Cr>Ru-Fe>Ru,且蘆丁配合物對金黃色葡萄球菌的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于蘆丁。實驗結(jié)果提示,第一過渡系生命元素的蘆丁配合物可能是生物活性比蘆丁更好的新型活性化合物,值得進一步研究和開發(fā)利用。

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