WT1 異構(gòu)體比例轉(zhuǎn)變對(duì)人白血病細(xì)胞株HL-60增殖和凋亡的影響*

徐 菁， 覃艷紅， 張翠明， 喬愛(ài)秀， 李靈敏， 王宏偉

(山西醫(yī)科大學(xué)1病理教研室，2第二醫(yī)院血液病研究所，3第二醫(yī)院超聲診斷科，山西 太原030001)

WT1(Wilms tumor 1)蛋白作為一種重要的轉(zhuǎn)錄 調(diào)控因子參與許多腫瘤特別是白血病的發(fā)生。WT1 mRNA 經(jīng)過(guò)選擇性剪接可以編碼4 種同源異構(gòu)體。在第5 外顯子處，編碼17 個(gè)氨基酸插入調(diào)控區(qū)與鋅指區(qū)之間，可把WT1 蛋白分為17AA+及17AA-2 種異構(gòu)體。在第9 外顯子末端即第3 和第4 鋅指結(jié)構(gòu)之間插入KTS(Lys-Thr-Ser)3 個(gè)氨基酸，從而又可將WT1 表達(dá)蛋白分為KTS+和KTS-2 種異構(gòu)體。通過(guò)不同的組合，可細(xì)分為4 種主要的剪接體，這4 種不同的含鋅指結(jié)構(gòu)的DNA 結(jié)合蛋白分別為17AA+/KTS+、17AA+/KTS-、17AA-/KTS+和 17AA-/KTS-。4 種異構(gòu)體比例的嚴(yán)格平衡在細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)節(jié)等方面起著重要作用［1-2］。

我們的前期工作證實(shí)人急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60 中4 種WT1 異構(gòu)體同時(shí)存在，在全反式維甲酸誘導(dǎo)分化前以17AA+/KTS+異構(gòu)體為主，而分化后以17AA-/KTS-為主［3］。為了進(jìn)一步明確WT1及其異構(gòu)體在白血病中的作用，我們將WT1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞，從而將HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，探討WT1 異構(gòu)體比例的轉(zhuǎn)變對(duì)HL-60 細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

PCDH1-MCS1-EF1-copGFP(簡(jiǎn)稱PCDH1)，全長(zhǎng)約7.5 kb，為帶有SV40 和PCMV 啟動(dòng)子、具有氨芐青霉素抗性基因的慢病毒質(zhì)粒載體，其與大腸桿菌DH5α、白血病細(xì)胞系HL-60 細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。三氧化二砷(As2O3)注射液購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco/BRL。限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ、EcoRⅠ及熒光定量試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購(gòu)自Invitrogen，引物及探針為上?；倒竞铣?。針對(duì)WT1 蛋白C 末端的抗C-19 兔抗人多克隆抗體和羊抗兔Ⅱ抗為Santa Cruz 產(chǎn)品，MTT 購(gòu)自Sigma，Annexin V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Coulter。

2 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA－ /KTS－)的構(gòu)建

根據(jù)WT1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體的全長(zhǎng)cDNA序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，分別在其上、下游引物5’端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Xba I 識(shí)別位點(diǎn)，上游引物為5’-CCGGAATTCTCAAAGCGCCAGCTGGAG-3’，下游引物為5’-GCTCTAGAATGCAGGACCCGGCTTC-3’(下劃線為引入的酶切位點(diǎn));從HL-60 細(xì)胞中提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，以cDNA 為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)WT1(17AA-/KTS-)基因序列，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒PCDH1 進(jìn)行雙酶切，回收并純化，T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，氨芐青霉素篩選挑取單克隆菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

采用LipofectamineTM2000 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，生長(zhǎng)良好的HL-60 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24 h 接種到6 孔板中，待細(xì)胞總面積達(dá)到60% ～80%，取3 μg 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA-/KTS-)和空載體PCDH1 分別進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染(具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，用600 mg/L G418 篩選具有抗性的細(xì)胞克隆，挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。

4 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)

引物及探針自行設(shè)計(jì)，由上海基康公司合成，引物及探針序列為:總WT1 探針，5’-FAM-CGGAGCCCAATACA-MGB-3’，上游引物5’-GATAACCACACAACGCCCATC-3’，下 游 引 物 5’-CACGTCGCACATCCTGAATG-3’;17AA+探針:5’-FAM-CAGCACAGGGATCGAGA-MGB-3’，上 游 引 物 5’-TGGACAGAAGGGCAGAGCA-3’，下 游 引 物 5’-GGATGGGCGTTGTGTGGT-3’;KTS+探針，5’-FAM-TTCCGGTCCGACCA-MGB-3’，上游引物5’-CAAAAGACACCAAAGGAGACATACA-3 ’，下 游 引 物 5 ’-CTGAAGGGCTTTTCACTTGTTTTAC-3’;β-actin 探 針，5’-FAM-ATCATTGCTCCTCCTGAG-MGB-3’，上游引物5’-GCTCAAAAGACACCAAAGGAGAC-3’，下游引物 5 ’-AGCTGAAGGGCTTTTCACTTGTTT-3 ’。 將WT1/β-actin、17AA+/β-actin 和KTS+/β-actin 分別作為WT1 基因及17AA+、KTS+異構(gòu)體的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

5 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞各1 ×107，溶解于裂解緩沖液(PBS中含10 g/L NP40、5 g/L 脫氧膽酸鈉、1 g/L SDS、1 mg/L 抑肽酶和100 mg/L PMSF)，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford 法定量蛋白，各取總蛋白45 μg 經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，分別用WT1 抗體和β-actin 抗體(Abcam)雜交，洗膜后再與生物素化的Ⅱ抗結(jié)合，DAB 顯色。采用Quantity One 軟件進(jìn)行圖像灰度分析，計(jì)算WT1 異構(gòu)體蛋白與β-actin的灰度比值以表示W(wǎng)T1 異構(gòu)體的相對(duì)表達(dá)量。

6 MTT 實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常HL-60 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒HL-60 細(xì)胞(以下簡(jiǎn)寫為HL-60/CMV)和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞(以下簡(jiǎn)寫為HL-60/WT1-/-)，以1 ×104cells/well 種植于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)對(duì)照組及加As2O3組(終濃度2 μmol/L)，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 和96 h 每孔加入5 g/L MTT 液20 μL，在37℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入DMSO 150 μL，振蕩混勻。測(cè)定各孔在570 nm 的吸光度(A570)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，抑制率(%)=(1 -A轉(zhuǎn)染組/A對(duì)照組)×100%。

7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

分對(duì)照組和加As2O3組(終濃度2 μmol/L)，分別于培養(yǎng)24、48 和72 h 后收集細(xì)胞，涂片后瑞特-姬姆薩染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

HL-60、HL-60/CMV 及HL-60/WT-/-單克隆細(xì)胞分為不加藥組和加As2O3組，分別于培養(yǎng)24、48和72 h 后收集細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1 ×109/L。根據(jù)Annexin V-FITC/PI 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，取100 μL 細(xì)胞懸液于試管中，依次加入Annexin V-FITC 5 μL 和PI 10 μL，混勻后于室溫避光孵育30 min，在檢測(cè)管中加入PBS 400 μL，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD 法)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒PCDH1-WT1(17AA－ /KTS－)的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)樣品的環(huán)狀質(zhì)粒樣條帶被酶切成2 條清晰的條帶，大小分別為7 500 bp 和1 500 bp 左右，與目的片段WT1(17AA-/KTS-)(1 493 bp)和PCDH1 質(zhì)粒(7 544 bp)的理論值大致相符，初步認(rèn)定為所需陽(yáng)性克隆構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果亦證實(shí)克隆出正確基因片段。

Figure 1. Identification of PCDH1-MCS1-EF1-copGFP recombinant vectors for WT1 isoforms. M:marker;1 and 2:PCR product of pCDH1;3 and 4:PCR product of pCDH1-WT1(17AA - /KTS - );3a and 4a:pCDH1-WT1(17AA - /KTS -)after enzyme digestion.圖1 WT1 異構(gòu)體插入慢病毒表達(dá)載體PCDH1-MCS1-EF1-copGFP 的PCR 和酶切鑒定

2 轉(zhuǎn)染基因mRNA 的檢測(cè)

HL-60/WT1-/-單克隆細(xì)胞中17AA-和KTS-異構(gòu)體表達(dá)均增高，17AA+異構(gòu)體比例由轉(zhuǎn)染前的0.60 ±0.04 降到轉(zhuǎn)染后的0.38 ±0.06;KTS+異構(gòu)體比例由0.53 ±0.08 降至轉(zhuǎn)染后96 h 的0.40 ±0.06，可見(jiàn)WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例已由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，差異顯著(P ＜0.05)。

3 轉(zhuǎn)染基因在蛋白水平的表達(dá)

Western blotting 顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體的單克隆細(xì)胞中WT1 (17AA-/KTS-)蛋白表達(dá)較對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 明顯增高(0.661 ±0.058 vs 0.295 ±0.070，0.661 ±0.058 vs 0.298 ± 0.025，P ＜0.05)，陽(yáng) 性 轉(zhuǎn) 染 組 WT1(17AA+/KTS+)蛋白表達(dá)較對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 明顯降低(0.394 ±0.036 vs 0.498 ±0.039，0.394 ±0.036 vs 0.489 ±0.027，P ＜0.05)，而對(duì)照組HL-60 和HL-60/CMV 之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖2、3。

Figure 2. The expression of WT1 isoforms in HL-60 cells detected by Western blotting. 1 ～3:HL-60/WT - / -;4:HL-60;5:HL-60/CMV圖2 Western blotting 檢測(cè)HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體的表達(dá)

Figure 3. The relative expression of WT1 isoforms detected by Western blotting. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖3 Western blotting 檢測(cè)WT1 異構(gòu)體的表達(dá)水平

4 As2O3 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

HL60/WT1-/-組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均明顯高于HL-60/CMV 及HL-60 組，差異顯著，進(jìn)一步提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 (17AA-/KTS-)異構(gòu)體能明顯抑制HL-60細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表1。

表1 MTT 法測(cè)定轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組在各時(shí)點(diǎn)的抑制率Table 1. Proliferation inhibitory rates at different time points measured by MTT (%.Mean±SD. n=3)

5 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

光鏡下可見(jiàn) HL-60、HL-60/CMV 和 HL-60/WT1-/-細(xì)胞核圓形，染色質(zhì)均勻疏松。加As2O3培養(yǎng)24 h 形態(tài)變化不明顯，處理48 h 后，各組細(xì)胞都出現(xiàn)了凋亡形態(tài)，細(xì)胞變形，胞膜完整，部分胞膜出現(xiàn)偽足樣突起，核固縮，染色質(zhì)凝聚于核周邊，處理72 h 凋亡進(jìn)一步加重;但凋亡形態(tài)改變以HL-60/WT1-/-更為明顯，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Apoptosis of HL-60 cells shown by Wright-Giemsa staining (× 1 000). A:HL-60-cells;B:HL-60 cells treated with As2O3 for 72 h;C:HL-60/CMV cells treated with As2O3 for 72 h;D:HL-60/WT1 - / - cells treated with As2O3 for 72 h.圖4 瑞特－姬姆薩染色觀察HL-60 細(xì)胞的凋亡

6 細(xì)胞早期凋亡的變化

不加藥物的2 組均以活細(xì)胞為主，僅有少量細(xì)胞凋亡。加As2O3(2 μmol/L)24 h 后，各組細(xì)胞Annexin V+/PI-亞群均增多，而HL-60/WT1-/-組Annexin V+/PI-亞群更明顯多于HL-60/CMV 及HL-60組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5、表2。此結(jié)果提示轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA-/KTS-)異構(gòu)體能夠增加HL-60 細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，使As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞的促凋亡作用更加明顯。

Figure 5. Early apoptotic rates of the transfected HL-60 cells analyzed by Annexin Ⅴ/PI double staining assay. A:HL-60 cells;B:HL-60 cells treated with As2O3 for 72 h;C:HL-60/CMV cells treated with As2O3 for 72 h;D:HL-60/WT1 - / - cells treated with As2O3 for 72 h.圖5 AnnexinⅤ/PI 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡

表2 As2O3 作用不同時(shí)間各組細(xì)胞的凋亡百分率Table 2. Apoptotic rates at different time points induced by As2O3(%. Mean±SD.n=3)

討 論

WT1 為一種具有激活和抑制雙重作用的轉(zhuǎn)錄因子，參與造血細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程的調(diào)控。近年來(lái)學(xué)者發(fā)現(xiàn)WT1 在各類白血病細(xì)胞中高表達(dá)，然而WT1 不同異構(gòu)體的存在及其功能的不同使得研究變得復(fù)雜，要真正明確WT1 在白血病中的作用及其機(jī)制尚需結(jié)合異構(gòu)體類型及比例作進(jìn)一步深入探討。

體外實(shí)驗(yàn)則表明WT1(KTS-)蛋白可通過(guò)調(diào)節(jié)一些基因如PDGFA、EGFR、PAX-2 和WT1 本身的表達(dá)而影響這些下游轉(zhuǎn)錄因子的活性及功能。有報(bào)道顯示W(wǎng)T1(17AA-)既能激活也能抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，這取決于此基因上究竟有1 個(gè)還是2 個(gè)WT1 核蛋白的DNA 結(jié)合位點(diǎn)［4］。Richard 等［5］將WT1 的4種異構(gòu)體分別轉(zhuǎn)染至人胚腎293 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)僅17AA+異構(gòu)體能抑制紫外線照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步顯示了17AA+異構(gòu)體在細(xì)胞凋亡中的抑制作用。Loeb 等［6］將WT1 (17AA-/KTS-)cDNA 轉(zhuǎn)染鼠源性造血祖細(xì)胞32Dcl3 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)WT1(17AA-/KTS-)可以減慢細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞分化，且減慢細(xì)胞周期。而Inoue 等［7］同樣采用鼠源性32Dcl3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1(17AA+/KTS+)異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)WT1(17AA+/KTS+)可以抑制細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖。我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)將HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體表達(dá)的比例由17AA+/KTS+優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-優(yōu)勢(shì)型，細(xì)胞增殖受到抑制，這與Loeb 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

目前對(duì)WT1 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制存在較多爭(zhēng)論，一般認(rèn)為WT1 通過(guò)與bcl-2、c-myc 等基因相互作用，在維持細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡起一定的作用。bcl-2 基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，其第 2 外顯子存在 WT1/EGR 結(jié)合的位點(diǎn)(GCGGGGGCG)，WT1 通過(guò)調(diào)節(jié)bcl-2 的轉(zhuǎn)錄而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控［8］。新近研究表明WT1 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡途徑，WT1 17AA+異構(gòu)體在內(nèi)源性凋亡途徑中在線粒體上游某些位點(diǎn)起著抗凋亡作用［9-10］。Menke 等［11］將WT1 基因4 種異構(gòu)體瞬間轉(zhuǎn)染2 種肝癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)WT1(KTS-)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而WT1(KTS+)則不能。我們的實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1 (17AA-/KTS-)異構(gòu)體能夠增加HL-60 細(xì)胞對(duì)As2O3的敏感性，使As2O3對(duì)HL-60 細(xì)胞的促凋亡作用更加明顯，這與Menke 等的研究結(jié)果大致相似。

綜上，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)WT1 (17AA-/KTS-)的白血病細(xì)胞株HL-60，觀察到HL-60 細(xì)胞中WT1 異構(gòu)體的優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?7AA-/KTS-后細(xì)胞增殖受抑制，對(duì)As2O3誘導(dǎo)的凋亡更加敏感，具體機(jī)制及其與增殖和凋亡相關(guān)基因之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

［1］ Lopotová T，Polák J，Schwarz J，et al. Expression of four major WT1 splicing variants in acute and chronic myeloid leukemia patients analyzed by newly developed four realtime RT PCRs［J］. Blood Cells Mol Dis，2012，49(1):41-47.

［2］ Kramarzova K，Stuchly J，Willasch A，et al.Real-time PCR quantification of major Wilms’tumor gene 1(WT1)isoforms in acute myeloid leukemia，their characteristic expression patterns and possible functional consequences［J］.Leukemia，2012，26(9):2086-2095.

［3］ 徐 菁，王宏偉，楊 濤，等. 維甲酸誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化過(guò)程中WT1 基因表達(dá)及其異構(gòu)體比例變化的研究［J］. 中華病理學(xué)雜志，2010，39(3):183-186.

［4］ Gannon AM，Turner EC，Reid HM，et al. Regulated expression of the alpha isoform of the human thromboxane A2receptor during megakaryocyte differentiation:a coordinated role for WT1，Egr1，and Sp1［J］. J Mol Biol，2009，394(1):29-45.

［5］ Richard DJ，Schumacher V，Royer-Pokora B，et al.Par4 is a coactivator for a splice isoform-specific transcriptional activation domain in WT1［J］.Genes Dev，2001，15(3):328-339.

［6］ Loeb DM，Summers JL，Burwell EA，et al.An isoform of the Wilms’tumor suppressor gene potentiates granulocytic differentiation［J］. Leukemia，2003，17(5):965-971.

［7］ Inoue K，Tamaki H，Ogawa H，et al. Wilms’tumor gene(WT1)competes with differentiation-inducing signal in hematopoietic progenitor cells［J］. Blood，1998，91(8):2969-2976.

［8］ 胡紹燕，陳子興，顧偉英，等. WT1 基因增強(qiáng)子構(gòu)建位點(diǎn)對(duì)WT1 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2008，24(2):209-214.

［9］ Ito K，Oji Y，Tatsumi N，et al. Antiapoptotic function of 17AA(+)WT1 (Wilms’tumor gene)isoforms on the intrinsic apoptosis pathway［J］. Oncogene，2006，25(30):4217-4229.

［10］Gu W，Hu S，Chen Z，et al. High expression of WT1 gene in acute myeloid leukemias with more predominant WT1 +17AA isoforms at relapse［J］. Leuk Res，2010，34(1):46-49.

［11］Menke AL，Shvarts A，Riteco N，et al. Wilms’tumor 1-KTS isoforms induce p53-independent apoptosis that can be partially rescued by expression of the epidermal growth factor receptor or the insulin receptor［J］. Cancer Res，1997，57(7):1353-1363.