糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B 對人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制

張承彥， 謝 鑫， 張春喜， 高登升

(1陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 西安710613;2西北大學(xué)，陜西 西安710069;3西安航天總醫(yī)院麻醉科，陜西 西安710100;4西安市第四醫(yī)院新生兒科，陜西 西安710014)

肝癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，尤其在40 ～50 歲的壯年男性發(fā)病較多，在各種腫瘤中惡性程度較高，嚴(yán)重影響人類的健康［1-2］。近年來盡管肝癌的診治取得了較大進(jìn)展，但關(guān)于肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲機(jī)制至今尚未完全闡明，肝癌手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是影響療效的主要原因之一。因此，肝癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移這一領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究不僅有重要的理論意義，而且有重要的應(yīng)用價值。

糖蛋白非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤蛋白B(glycoprotein nonmetastatic melanoma protein B，GPNMB)是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在結(jié)構(gòu)上分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)，其胞內(nèi)段具有整合素識別位點(diǎn)——精氨酸-甘氨酸- 天冬氨酸(arginine-glycine-asparagine，RGD)序列，具有細(xì)胞黏附功能。gpnmb 廣泛表達(dá)于多種組織，如皮膚基底層、毛囊生發(fā)細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、破骨細(xì)胞等［3］。近年來的研究表明，它參與了多種細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等生理過程，而異常表達(dá)的GPNMB 還與多種疾病的病理、生理過程相關(guān)［4］。但GPNMB 在肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制如何，目前國內(nèi)外研究報道還較少。因此，本研究通過GPNMB 基因轉(zhuǎn)染和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)刺激體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞，觀察GPNMB 過表達(dá)和GPNMB-siRNA 對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，進(jìn)一步明確GPNMB 在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株HepG2 購于中科院上海細(xì)胞所，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器及試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Binder)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Sheldon)，流式細(xì)胞儀(Olympus)，iQ5 實(shí)時定量PCR 儀和激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad)，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(Boehringer Mannheim)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RNAiso Plus、PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR? Premix Ex TaqTMI、EcoR I、Xho I 和T4 DNA 連接酶(TaKaRa)，抗β-肌動蛋白抗體、抗整合素β1抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、LipofectamineTMRNAiMAX、載體pMD19-T、pcDNA3.1(+)和抗GPNMB 抗體(Abcam)，M254 培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜(demethylsulfoxide，DMSO)、TBST 緩沖液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和碘化丙啶(propidium iodide，PI;Gibco-BRL)。

1.3 引物 所有引物均由上海生工合成，其序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Primer sequences

2 方法

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 將以GPNMB-P2 為引物擴(kuò)增的GPNMB 目的片段，與pMD19-T 載體在16 ℃條件下進(jìn)行連接反應(yīng)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后進(jìn)行篩選，挑選陽性菌落搖菌并提取質(zhì)粒，電泳鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMD19TGPNMB。以重組質(zhì)粒為模板，以GPNMB-P3 為引物，擴(kuò)增GPNMB 編碼區(qū)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物以EcoRI 和Xho I 雙酶切，并用T4 DNA 連接酶將其與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，獲得重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-GPNMB。

2.2 轉(zhuǎn)染 按5 ×104cells/well 接種HepG2 細(xì)胞至24 孔培養(yǎng)板中，待其長至60% 融合時，采用LipofectamineTM2000 將siRNA 或重組表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)-GPNMB 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，混勻后于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。24 h 后采用Western blotting法檢測各組的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 RNA 的提取與real-time PCR 檢測 采用RNAiso Plus 試劑盒提取HepG2 細(xì)胞中的總RNA，按照試劑盒要求操作。按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增。Real-time PCR 采用的體系為:dNTPs 2 μL，10 ×buffer 5 μL，上、下游引物各10 pmol/L，Pfu酶0.5 μL，模板2 μL，加三蒸水至總體積50 μL;擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃1 min，60 ℃1 min，延伸72 ℃3 min，30 個循環(huán)后，72℃5 min。以β-actin 為內(nèi)參照，依據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞mRNA 的相對表達(dá)量。

2.4 Western blotting 檢測樣品的蛋白水平 每個樣品取40 μg 蛋白進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE 電泳，蛋白濃度采用BCA 試劑盒測定。經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，10%脫脂奶粉4 ℃封閉PVDF 膜過夜，加10%脫脂奶粉稀釋好的Ⅰ抗加于膜上，室溫反應(yīng)60 min;用TBST 緩沖液(0.05 mol/L Tris，0. 15 mol/L NaCl，0.05% Tween 200)洗膜10 min ×3 次;加Ⅱ抗37 ℃孵育45 min，TBST 緩沖液洗膜10 min ×3 次，滴加ECL 試劑，將PVDF 膜放入X 光片暗盒，在暗室中壓片，顯影。以β-actin 作為內(nèi)參照。

2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔1 ×104，共100 μL，每組3 孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、GPNMB 過表達(dá)組、GPNMB-siRNA 組及scrambled 組(即空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，主要是為了說明干擾試驗(yàn)的特異性)，0.25%胰酶消化各組細(xì)胞，吸去胰酶，加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 min。每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后進(jìn)行比色測定，酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 波長下讀取吸光度(absorbance，A)。

2.6 細(xì)胞凋亡測定 用PBS 洗滌HepG2 細(xì)胞1 次，加入Annexin V-FITC，室溫避光放置20 min，用PBS洗滌2 次，加500 μL 甲醛，冰浴25 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2 次，加入含有10 mg/L PI 和1 mg/L RNA 酶的PBS 緩沖液，室溫避光孵育20 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

2.7 細(xì)胞侵襲能力測定 實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、GPNMB 過表達(dá)組、GPNMB-siRNA 組以及scrambled組，將培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2 細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3 次，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整成2 ×108cells/L 備用。預(yù)先將Matrigel(提前12 h)用無血清培養(yǎng)基DMEM 稀釋成1∶3 濃度，均勻地鋪滿Transwell 小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h，使Matrigel 凝固形成基質(zhì)膜。Transwell 下室加入700 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，小室內(nèi)接種200 μL無血清細(xì)胞懸液，培養(yǎng)18 h 后取出Transwell膜，預(yù)冷的PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 ～10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)穿過Transwell 膜的細(xì)胞數(shù)［5］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染效率的測定

取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞總RNA 和蛋白，采用realtime PCR 和Western blotting 檢測GPNMB 的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。Scrambled 組HepG2 細(xì)胞中GPNMB 的mRNA 表達(dá)水平較對照組無明顯變化，而GPNMB 過表達(dá)組和GPNMB-siRNA 組HepG2 細(xì)胞中GPNMB 的mRNA 表達(dá)水平分別為1.28 ±0.09 和0.62 ±0.03，與對照組相比差異顯著(P ＜0.05)，見圖1。與對照組相比，scrambled 組HepG2 細(xì)胞中GPNMB 蛋白表達(dá)水平幾乎無變化，而GPNMB 過表達(dá)組蛋白表達(dá)水平顯著升高，GPNMB-siRNA 組蛋白表達(dá)水平明顯降低，見圖2。

Figure 1. The mRMA expression of GPNMB detected by realtime PCR.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖1 Real-time PCR 檢測GPNMB mRNA 表達(dá)

2 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響

MTT 法測定各組細(xì)胞的A 值，結(jié)果見圖3。與對照組相比，scrambled 組基本無變化，GPNMB 過表達(dá)可以顯著促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖，其A 值是對照組的1.4 倍，差異顯著(P ＜0.05);而GPNMB-siRNA則可以顯著抑制HepG2 細(xì)胞的增殖，其A 值僅為對照組的0.4 倍，差異顯著(P ＜0.05)。

Figure 2. The protein expression of GPNMB detected by Western blotting.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖2 Western blotting 檢測GPNMB 蛋白表達(dá)

Figure 3. The effect of GPNMB on HepG2 cell proliferation.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖3 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響

3 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V/PI 熒光強(qiáng)度的結(jié)果見圖4。與對照組相比，scrambled 組、GPNMB 過表達(dá)及GPNMB-siRNA 組的總細(xì)胞凋亡率均無明顯差異(P ＞0.05)。

4 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞侵襲的影響

與對照組相比，scrambled 組基本無變化，GPNMB 過表達(dá)組細(xì)胞發(fā)生侵襲的個數(shù)為124 ±9，顯著增多(P ＜0.05)，GPNMB-siRNA 組細(xì)胞發(fā)生侵襲的個數(shù)為36 ±3，顯著減少(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 4. Effect of GPNMB on HepG2 cell apoptosis.圖4 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. Effect of GPNMB on HepG2 cell invasion.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs control.圖5 GPNMB 對HepG2 細(xì)胞侵襲的影響

5 GPNMB 通過整合素β1 調(diào)控HepG2 細(xì)胞增殖與侵襲

僅用整合素β1-siRNA 處理時，HepG2 細(xì)胞的GPNMB 蛋白表達(dá)水平較對照組和scrambled 組下調(diào);而同時用整合素β1-siRNA 和GPNMB 過表達(dá)處理時，HepG2 細(xì)胞的GPNMB 蛋白表達(dá)水平較整合素β1-siRNA 組上調(diào)，見圖6。僅用整合素β1-siRNA 處理時，細(xì)胞增殖與侵襲能力均顯著下降(P ＜0.05);而同時用整合素β1-siRNA 和GPNMB 過表達(dá)處理細(xì)胞，則可促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲(P ＜0.05)。

討 論

Figure 6. The GPNMB protein levels in HepG2 cells with different treatments.Mean±SD. n =3. * P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs integrin β1-siRNA.圖6 不同處理因素作用下HepG2 細(xì)胞GPNMB 蛋白表達(dá)水平的變化

癌癥患者死亡的主要原因是腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，增殖和侵襲是所有惡性腫瘤的共同特征，也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者臨床治療預(yù)后差，易復(fù)發(fā)的主要原因［6］。腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲是癌基因與抑癌基因共同參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，可以通過腫瘤增殖、侵襲相關(guān)基因的過度表達(dá)或下調(diào)，以及一系列基因產(chǎn)物的參與，對腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移整個過程進(jìn)行調(diào)控［7］。在MTT 實(shí)驗(yàn)中，HepG2 細(xì)胞在GPNMB 表達(dá)被特異性沉默后增殖速率明顯下降，這表明GPNMB直接影響肝癌細(xì)胞的生長活力，對肝癌細(xì)胞的增殖起著重要作用。Annexin V/PI 雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，GPNMB 對HepG2 細(xì)胞凋亡基本無影響，這說明GPNMB 在肝癌細(xì)胞增殖過程中的影響不是決定性的。文獻(xiàn)也表明，正常肝臟組織的肝細(xì)胞GPNMB 蛋白低表達(dá)，但在肝癌細(xì)胞中高度表達(dá)［8］，即正常肝細(xì)胞在GPNMB 蛋白表達(dá)水平很低的情況下能正常增殖，而在增殖速率較快的肝癌細(xì)胞中降低GPNMB 蛋白表達(dá)水平只會減慢細(xì)胞的增殖，但不會引起致死性的變化。

Figure 7. GPNMB regulated the proliferation and invasion of HepG2 cells through interaction with integrin β1.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs integrin β1-siRNA.圖7 GPNMB 通過整合素β1 調(diào)控HepG2 細(xì)胞的增殖與侵襲

整合素為α 和β 亞基非共價鍵連接而形成的異二聚體的跨膜糖蛋白，是一類重要的細(xì)胞表面受體，其配體主要為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，整合素通過識別胞外基質(zhì)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，并接受、轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)信號以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、運(yùn)動、增殖等生物學(xué)過程，在腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中起重要的作用［9-10］。正常成人肝細(xì)胞沒有基膜，僅低水平表達(dá)3 種整合素:α1β1、α5β1和α9β1，但當(dāng)肝細(xì)胞癌變時，上述幾種整合素受體有較大改變。肝癌細(xì)胞整合素β1亞基在肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞膜表面具有較強(qiáng)的表達(dá)，其表達(dá)明顯高于正常肝細(xì)胞［11］。本研究采用RNA 干擾技術(shù)沉默整合素β1亞基，研究GPNMB 對HepG2 細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅用整合素β1-siRNA 處理時，細(xì)胞增殖和侵襲能力均顯著下降;而同時用整合素β1-siRNA 和GPNMB 過表達(dá)處理細(xì)胞，則可促進(jìn)其增殖和侵襲。有文獻(xiàn)報道，CD151(四跨膜蛋白超家族中的一重要分子)在體外可通過整合素通路促進(jìn)HepG2 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12］，由此我們推測，GPNMB 對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響可能也是通過整合素β1起作用。由于腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲機(jī)制是一個復(fù)雜的、多步驟的過程，其幕后的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制起著決定性作用，而本研究僅考察了整合素β1在肝癌細(xì)胞上的表達(dá)及影響，其它整合素亞型的表達(dá)及貢獻(xiàn)大小、多種胞外配體分子協(xié)同作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

［1］ 華赟鵬，李寶金，汪 勇，等. ATP 啟動子驅(qū)動的yCD/TK 雙自殺基因靶向殺傷肝癌細(xì)胞的體內(nèi)外研究［J］. 中國病理生理雜志，2009，25(6):1111-1116.

［2］ Lyra-González I，F(xiàn)lores-Fong LE，González-García I，et al. Adenoviral gene therapy in hepatocellular carcinoma:a review［J］. Hepatol Int，2013，7(1):48-58.

［3］ Hoashi T，Sato S，Yamaguchi Y，et al. Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b，a melanocytic cell marker，is a melanosome-specific and proteolytically released protein［J］. FASEB J，2010，24(5):1616-1629.

［4］ Tomihari M，Hwang SH，Chung JS，et al. Gpnmb is a melanosome-associated glycoprotein that contributes to melanocyte/keratinocyte adhesion in a RGD-dependent fashion［J］. Exp Dermatol，2009，18(7):586-595.

［5］ Choi ET，Engel L，Callow AD，et al. Inhibition of neointimal hyperplasia by blocking αVβ3integrin with a small peptide antagonist GpenGRGDSPCA［J］. J Vasc Surg，1994，19(1):125-134.

［6］ Tsujimoto M，Aozasa K，Nakajima Y，et al. Hepatocellular carcinoma with sarcomatous proliferation showing an unusual and wide-spread metastasis［J］. Acta Pathol Jpn，1984，34(4):839-845.

［7］ 郭曉鶴，張彩鳳，夏永華，等. CADM 過表達(dá)對人胃癌MKN-45 細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其分子機(jī)制［J］. 中國病理生理雜志，2012，28(12):2283-2287.

［8］ Zhou L，Liu F，Li Y，et al. Gpnmb/osteoactivin，an attractive target in cancer immunotherapy［J］. Neoplasma，2012，59(1):1-5.

［9］ Desgrosellier JS，Cheresh DA. Integrins in cancer:biological implications and therapeutic opportunities［J］. Nat Rev Cancer，2010，10(1):9-22.

［10］Raymond K，F(xiàn)araldo MM，Deugnier MA，et al. Integrins in mammary development［J］. Semin Cell Dev Biol，2012，23(5):599-605.

［11］Sahin AO，Buitenhuis M. Molecular mechanisms underlying adhesion and migration of hematopoietic stem cells［J］. Cell Adh Migr，2012，6(1):39-48.

［12］Sadej R，Romanska H，Kavanagh D，et al. Tetraspanin CD151 regulates transforming growth factor β signaling:implication in tumor metastasis［J］. Cancer Res，2010，70(14):6059-6070.