槲皮素對ox-LDL 所致的小鼠巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和過氧化的影響*

苗 成， 李金國， 苗 芳， 焦 鵬， 田 華， 方永奇， 秦樹存△， 姚樹桐，△

(泰山醫(yī)學院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校重點實驗室，2基礎醫(yī)學院，山東 泰安271000)

心腦血管疾病位居人類疾病譜首位，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎，而泡沫細胞尤其巨噬細胞源性泡沫細胞是AS 的重要標志，并在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。由清道夫受體介導的巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL)的無限制攝取是泡沫細胞形成的重要環(huán)節(jié)，其中CD36 是巨噬細胞表面主要識別、內(nèi)吞ox-LDL 的清道夫受體，其結合和攝取的ox-LDL 占巨噬細胞結合和攝取修飾脂質(zhì)的50%以上［2］，因此調(diào)控CD36 表達可能對抑制泡沫細胞形成、阻止AS 進展具有重要意義。槲皮素(quercetin，QUE)是廣泛存在于蜂膠、紅酒、水果和茶葉中的小分子黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血壓等藥理作用［3-4］。本課題組既往研究證實，QUE 可抑制ox-LDL 所誘導的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積［5］，但其機制尚不清楚。本研究在ox-LDL 誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞模型上，研究槲皮素對CD36表達及氧化應激反應的影響，以探討其調(diào)控巨噬細胞泡沫化的機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

QUE、油紅O 和2’，7’-二氯熒光素二乙酸脂(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)為Sigma 產(chǎn)品;DMEM 高糖培養(yǎng)基和RIPA 裂解液分別購自Gibco 和Solarbio;兔抗CD36 和β-actin 抗體購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 為北京中杉金橋產(chǎn)品;Trizol 試劑購自Invitrogen;cDNA合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品;增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和PVDF 膜分別為Pierce 和Millpore 產(chǎn)品;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 LDL 分離與氧化 按照文獻［6］方法制備ox-LDL，即采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿LDL，用不含EDTA 的PBS 液透析48 h，隨后在含10 μmol/L CuSO4的PBS 液(pH 7.2)中37 °C 溫育透析18 h，最后在含100 μmol/L EDTA 的PBS 中4 ℃透析24 h。過濾除菌，BCA 試劑定量蛋白，用PBS 調(diào)蛋白濃度至1 g/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩y定硫代巴比妥酸反應物質(zhì)MDA 的濃度(＞30 μmol/g);且瓊脂糖凝膠電泳顯示ox-LDL 電泳遷移率增快，為LDL 的2.0 ～2.5 倍。

2.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組 鼠源RAW264.7 巨噬細胞由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供，用DMEM 高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素1 ×105U/L 和鏈霉素100 mg/L)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機分為(1)正常對照(control)組:培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng);(2)ox-LDL 組:培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL;(3)QUE 預處理組:培養(yǎng)液中先加入QUE (20、40 和80 μmol/L)預處理30 min，再加入100 mg/L ox-LDL。除QUE 預處理組外，其它各組均加入體積分數(shù)為0.1%的二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，培養(yǎng)24 h 收集細胞。

2.3 油紅O 染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化［6］將細胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞經(jīng)處理后，PBS 潤洗，4%鈣甲醛溶液固定，油紅O 染色液染色15 min，蘇木素復染。Olympus BX51 顯微鏡觀察，細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。每張爬片隨機選取5 個區(qū)域，采用Image-Pro Plus 6. 0 (Media Cybernetics)圖像分析軟件分析實驗結果，細胞內(nèi)脂滴含量以細胞平均積分吸光度(integrated absorbance，IA)值表示。

2.4 細胞培養(yǎng)液中LDH 活性和MDA 含量檢測

將細胞培養(yǎng)于6 孔板中，經(jīng)處理后收集細胞培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書比色法測定細胞培養(yǎng)液中LDH 活性和MDA 含量。

2.5 DCFH-DA 熒光探針檢測細胞活性氧( reactive oxygen species，ROS) 水平 將細胞接種于96 孔板，經(jīng)處理后，裝載探針，使DCFH-DA 終濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育30 min 后，無血清培養(yǎng)液洗細胞3 次。多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。以對照組ROS 水平為100%，其它各組ROS 水平以其熒光強度占對照組熒光強度的百分比表示。

2.6 Real-time PCR 檢測CD36 mRNA 表達 按照Trizol 試劑說明提取各組細胞總RNA。按RNA 逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA 產(chǎn)物。按real-time PCR試劑盒說明書準備20 μL PCR 擴增反應體系:SYBR Green 9 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水5 μL。在real-time PCR 儀(Rotor-Gene Q 型，上海Qiagen 公司)上反應，條件為94 ℃預變性10 min，94℃20 s，55℃30 s，70 ℃30 s，40 個循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參照。CD36 上游引物5’-GAACCTATTGAAGGCTTACATCC-3’，下游引物5’-CCCAGTCACTTGTGTTTTGAAC-3’，擴增長度246 bp;β-actin 上游引物5’-CGGGGACCTGACTGACTACC-3’，下游引物5’-AGGAAGGCTGGAAGAGTGC -3’，擴增長度251 bp。

2.7 Western blotting 檢測CD36 蛋白表達 按照RIPA 蛋白提取試劑盒說明書提取各組細胞蛋白，經(jīng)定量、變性處理并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠)后電轉印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉后分別用兔抗CD36 (1∶300)和β-actin 抗體(1∶500)多克隆抗體室溫孵育3 h，洗膜后用辣根過氧化物酶標記相應II 抗孵育2 h。免疫條帶用ECL 法顯示，暗室曝光，采用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶IA 值，以CD36 IA 值與β-actin IA 值的比值反映CD36 相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 QUE 抑制ox-LDL 所誘導的RAW264.7 巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

正常對照組油紅O 染色陽性細胞少或無;ox-LDL 組油紅O 染色陽性細胞遍布;QUE (20、40 和80 μmol/L)預處理組油紅O 染色陽性細胞明顯減少，其平均IA 值分別為ox-LDL 組的80.6%、62.9%和51.8% (后兩者P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1. QUE reduced ox-LDL-induced intracellular lipid accumulation in RAW264.7 cells. Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h. The intracellular lipid droplets were stained by oil red O (×1 000). Mean±SD. n=6. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖1 QUE 減輕ox-LDL 所誘導的RAW264.7 細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

2 QUE 降低ox-LDL 所致的細胞LDH 釋放

不同濃度的QUE 均可顯著抑制ox-LDL 所致的LDH 釋放，分別較ox-LDL 組降低25.4%、33.3%和42.1% (P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖2。

3 QUE 對細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液MDA 水平的影響

ox-LDL 組細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液中MDA 含量均明顯升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而與ox-LDL 組比較，QUE 預處理組ROS和MDA 含量均顯著降低，尤以80 μmol/L QUE 組更為明顯(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 2. Suppressive effect of QUE on ox-LDL-induced LDH release in macrophages. Mean±SD. n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖2 QUE 降低ox-LDL 所致的細胞LDH 釋放

Figure 3. Effects of QUE on the levels of intracellular ROS (A)and MDA in culture medium (B). Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖3 QUE 對細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液MDA 水平的影響

4 QUE 抑制ox-LDL 誘導的CD36 mRNA 和蛋白表達上調(diào)

QUE 明顯抑制ox-LDL 所誘導的CD36 mRNA 上調(diào)，且呈濃度依賴性(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖4A。

免疫印跡結果顯示，與對照組比較，ox-LDL 處理組CD36 蛋白水平明顯增加;而給予20、40 和80 μmol/L QUE 預處理，CD36 較ox-LDL 處理組分別降低23. 1%、28. 5% 和45. 1% (P ＜0. 05 或P ＜0.01)，見圖4B。

討 論

Figure 4. Effects of QUE on CD36 expression in RAW264.7 cells. Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h. The mRNA (A)and protein (B)levels of CD36 were analyzed by realtime PCR and Western blotting，respectively. Mean±SD. n = 4. * P ＜0. 05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖4 QUE 對CD36 表達的影響

AS 是一種由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞等多種細胞參與的慢性炎癥反應，而ox-LDL 是公認的誘導血管壁炎癥反應的重要危險因素，在AS發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。ox-LDL 與正常LDL主要區(qū)別在于其中的氧化成分，如氧化膽固醇組分等。單核細胞來源的巨噬細胞大量攝取ox-LDL 進而形成泡沫細胞，甚至死亡崩解，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)核心，其主要原因是由于ox-LDL 中的氧化成分對巨噬細胞的氧化損傷［7］。本實驗結果顯示，給予ox-LDL 處理細胞24 h，巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著，ROS水平和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 明顯增加，且反映細胞損傷的LDH 釋放明顯增多，表明巨噬細胞損傷與ox-LDL 引起的脂質(zhì)過氧化有關。因此增強單核/巨噬細胞抗氧化損傷能力可能對AS 疾病的防治具有重要意義。

QUE 又名五羥黃酮、槲皮酮，在植物界分布廣泛，具有抗氧化、降血脂、降血壓、增加冠脈血流量、減少毛細血管脆性、抗菌消炎等多種生物活性［3-4］。Kawai 等［8］檢測動脈壁中槲皮素代謝產(chǎn)物——槲皮素葡糖苷酸的分布，結果顯示其主要分布于粥樣病變處，且以巨噬細胞源性泡沫細胞中更甚，提示巨噬細胞可能作為槲皮素抗AS 的治療靶點。文獻報道［9］和我們既往研究［10］表明QUE 可增強小鼠巨噬細胞的抗氧化能力，抑制脂多糖所誘導的氧化應激反應，并減輕毒胡蘿卜素所致巨噬細胞損傷。本實驗結果顯示，QUE 可抑制ox-LDL 所誘導的細胞LDH釋放，并減少ROS 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的生成，表明QUE 可減輕ox-LDL 所誘導的巨噬細胞脂質(zhì)過氧化損傷。

由清道夫受體介導的對ox-LDL 無限制攝取是泡沫細胞形成和AS 發(fā)生發(fā)展的關鍵，其中B 類清道夫受體CD36 是巨噬細胞表面主要識別、內(nèi)吞ox-LDL 的清道夫受體，其結合和攝取的ox-LDL 占巨噬細胞結合和攝取修飾脂質(zhì)的50%以上［2］。研究表明由ox-LDL 啟動的CD36 依賴性信號轉導途徑可能為泡沫細胞形成所必需［11-12］。本課題組既往研究證實，QUE 可通過上調(diào)三磷酸腺苷結合盒式轉運體A1表達抑制泡沫細胞形成［13］。本實驗進一步探討了QUE 對CD36 表達的調(diào)控作用，結果顯示QUE 可明顯抑制巨噬源性泡沫細胞形成和細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，并在mRNA 和蛋白水平均可抑制ox-LDL 所誘導的CD36 表達上調(diào)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)QUE 可減輕ox-LDL 所誘導的RAW264.7 巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和脂質(zhì)過氧化損傷，其機制可能與下調(diào)CD36 表達有關，而關于QUE對CD36 表達調(diào)控的上游分子機制仍有待進一步研究。

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