中國(guó)北方漢族人CYP7A1 基因rs2162459 多態(tài)性與阿托伐他汀療效的關(guān)系*

王國(guó)昌， 陳曉明， 李淑元， 張娜娜， 鄭麗娟，陳甜甜， 莊茂強(qiáng)， 張 琳， 陳煥芹， 呂 明△

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1 臨床流行病研究室，2 老年心血管內(nèi)科，山東 濟(jì)南250012;3復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200433)

目前研究認(rèn)為人體對(duì)藥物降脂療效是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致，而遺傳決定了機(jī)體對(duì)藥物處置差異的20% ～95%［1-2］，提示人們可以在研究基因序列的多態(tài)性變異方面探索決定藥物療效差異的因素。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P-450 第7 家族A亞族多肽1(CYP7A1)基因第1 內(nèi)含子rs8192870［3］以及A-204C 位點(diǎn)的多態(tài)性均與阿托伐他汀降低LDL 的療效有關(guān)［4，13］。膽固醇7α-羥化酶由CYP7A1編碼，是體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的經(jīng)典合成途徑的第一限速酶［5-6］，而膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是其體內(nèi)代謝的主要去路［7-9］。rs2162459 位于CYP7A1 基因的第1 內(nèi)含子區(qū)域，本研究旨在探討rs2162459 位點(diǎn)多態(tài)性和阿托伐他汀降脂療效的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

研究對(duì)象來自于2011 年3 月至2011 年12 月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心內(nèi)科收治的高脂血癥入院患者，均為漢族人，共200 例。納入標(biāo)準(zhǔn):受試者總膽固醇(total cholesterol，TC)≥5.72 mmol/L(220 mg/dL)或甘油三酯(triglyceride，TG)≥1.70 mmol/L(150 mg/dL)或使用調(diào)脂藥，受試者接受藥物洗脫期2 周，年齡18 ～70 周歲，無活動(dòng)性肝病，依從性較好，整個(gè)研究期間保持低脂低膽固醇飲食;排除標(biāo)準(zhǔn):對(duì)羥甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶抑制劑高度過敏者，心功能三級(jí)或四級(jí)，血壓控制不佳者即收縮壓＞180 mm-Hg 或舒張壓＞110 mmHg，繼發(fā)性高脂血癥患者，高膽紅素血癥，腎功能損害或伴有腎病綜合癥以及曾經(jīng)或現(xiàn)患肌肉組織疾病，仍在服用已知會(huì)影響血脂水平或與研究藥物存在相互作用或與研究藥物合用會(huì)增加橫紋肌溶解危險(xiǎn)性的藥物?；颊哐芯科陂g口服阿托伐他汀20 mg/d，服用8 周。

2 高脂血癥降脂療效的判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)衛(wèi)生部1993 年頒發(fā)的《心血管藥物臨床研究指導(dǎo)原則》和中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部1998 年頒布的《藥物臨床研究指導(dǎo)原則規(guī)定》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效判定，分別統(tǒng)計(jì)治療8 周后的血清低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、TC、TG及高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的變化百分率，標(biāo)準(zhǔn)如下:

有效:與用藥前相比，復(fù)查時(shí)達(dá)到以下任意一項(xiàng):TC 下降10% ～20%，TG 下降20% ～40%，HDL-C 上升0.104 ～0.260 mmol/L，LDL-C 下降10% ～20%。

無效:未達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)者。

3 方法

3.1 臨床資料和血液樣本的收集 在患者知情同意的基礎(chǔ)上采用專門的調(diào)查表對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行面對(duì)面訪談，內(nèi)容包括一般項(xiàng)目、生活方式、病史及家族史、調(diào)脂藥物用藥史。分別于研究的0 和8 周采集早晨空腹靜脈血5 mL，抗凝血用于DNA 提取，非抗凝血用于生化指標(biāo)的檢測(cè)。

3.2 生化指標(biāo)測(cè)定 采用日立717S 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定患者的TC、TG、LDL-C、HDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B、脂蛋白(a)以及腎功能和血糖等指標(biāo)，此過程由山東大學(xué)齊魯醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。

3.3 DNA 的提取 取收集好的抗凝血2 mL，采用北京艾德萊生物科技有限公司提供的小量全血基因組提取試劑盒抽提基因組DNA，NanoDrop 3.8.1 分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，標(biāo)化至10 mg/L，-20 ℃冷凍以備基因型檢測(cè)。

3. 4 多重單堿基延伸SNP 分型技術(shù)( multiplex SNaPshot) 檢測(cè)CYP7A1 基因多態(tài)性

3.4.1 原理 在一個(gè)含有測(cè)序酶、4 種熒光標(biāo)記的ddNTP、緊挨多態(tài)位點(diǎn)5'端的不同長(zhǎng)度延伸引物和PCR 產(chǎn)物模板的反應(yīng)體系中，引物延伸1 個(gè)堿基即終止，如果是雜合子，2 種堿基都得到延伸，從而表現(xiàn)為雙峰，而純合子只有1 種堿基得到延伸，表現(xiàn)為相應(yīng)的單峰，經(jīng)ABI 測(cè)序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，根據(jù)峰移動(dòng)的膠位置確定該延伸引物對(duì)應(yīng)的SNP 位點(diǎn)。該技術(shù)分型準(zhǔn)確，速度快，適用于小樣本多位點(diǎn)的基因型檢測(cè)。

3.4.2 工作流程

①引物合成 委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成引物合成，正向引物5'-GGCCCATCCAACAAAAGAAAT-3'，反向引物5'-GCAGAGCACAGCCCAGGTAT-3'，延伸引物5'-TTTTTTTTTTTTTTCGTTTGCCTGTCAGACACAA-3'。②待分析片段的PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系(8 μL):包括10 ×buffer 0.8 μL，0.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，1 μL dNTP 混合物(10 mmol/L)，待定型分析片段的PCR 擴(kuò)增用引物(正向引物和反向引物)0. 1 μL，F(xiàn)astStar Taq 酶0.15 μL，DNA 模板1 μL(10 mg/L)，ddH2O 4.45 μL。采用Touchdown PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性15 min，94 ℃20 s，62 ℃40 s，-0.5 ℃/循環(huán)，72 ℃90 s，共11 個(gè)循環(huán)。然后94 ℃20 s，57 ℃30 s，72 ℃90 s，共22 個(gè)循環(huán)。最后72 ℃5 min。反應(yīng)產(chǎn)物純化:取2 μL 的待定型分析片段模板中加入1 μL 蝦堿性磷酸酶(Promega)和0. 2 μL 外切酶(ExonⅠ)，反應(yīng)體系混勻，37 ℃反應(yīng)80 min，75 ℃15 min 失活蝦堿性磷酸酶，完成PCR 產(chǎn)物純化。

③SNaPshot 反應(yīng) 反應(yīng)體系(6 μL)包括:5 ×buffer 1.2 μL，SNaPshot Master Mix 1 μL(ABI)，延伸引物混合物2 μL，純化的待定型分析片段模板1 μL，ddH2O 0.8 μL。反應(yīng)程序:96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃10 s，52 ℃5 s，60 ℃30 s，共28 個(gè)循環(huán)。單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物的純化:在上述的反應(yīng)體系中加入1 μL蝦堿酶，反應(yīng)體系混勻，37 ℃80 min，75 ℃15 min完成SNaPshot 產(chǎn)物純化。

④DNA 測(cè)序儀測(cè)序 在上述純化產(chǎn)物(1 μL)中加入9 μL 的分子量?jī)?nèi)標(biāo)GeneScan-120 LIZ(Applied Biosystems;0.2 μL)和甲酰胺(Hi-DiTMformamide;Applied Biosystems;8.8 μL)的混合物，混勻，由ABI 3130基因分析儀毛細(xì)管電泳分析，運(yùn)行Peak Scanner 1.0軟件分析，讀取測(cè)序結(jié)果。

上述基因型測(cè)定過程在復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間均數(shù)的比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料的比較用χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)樣本的代表性。采用多元logistic 回歸模型分析rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性和阿托伐他汀降脂療效之間的關(guān)系。采用SAS 9.1 軟件完成。

結(jié) 果

1 高脂血癥患者的一般臨床資料

高脂血癥患者共有200 例，男女分別為127 和73 例，既往各種疾病史等資料見表1。

表1 高脂血癥患者的臨床資料Table 1. Clinical data of hyperlipidemia patients(n=200)

2 rs2162459 位點(diǎn)Hardy-Weinberg 遺傳平衡的檢驗(yàn)

rs2162459 位點(diǎn)3 種基因型頻數(shù)分別為43、106和51，等位基因A 和G 的頻率分別是48%和52%。χ2檢驗(yàn)的結(jié)果顯示rs2162459 位點(diǎn)基因型頻率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡，χ2=0.7613，P ＞0.05，說明收集的樣本具有群體代表性。

3 rs2162459 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布的特點(diǎn)

表2 顯示rs2162459 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率的分布情況，根據(jù)降脂療效的不同，把4 種血脂指標(biāo)分成有效組和無效組，比較兩組之間的基因型和等位基因的分布。rs2162459 基因型AA、GA、GG 以及等位基因A 和G 在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

4 rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性和臨床生化指標(biāo)的關(guān)系

表3 顯示rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性和基線血脂水平的關(guān)系，HDL-C 水平在rs2162459 三個(gè)基因型AA、GA 和GG 間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.05，從AA、GA 到GG 高密度脂蛋白膽固醇水平依次降低，濃度分別為(1. 36 ± 0. 94)mmol/L、(1. 16 ±0.38)mmol/L 和(1.07 ±0.28)mmol/L，提示基因型GG 和低HDL-C 水平有一定的關(guān)系。

表2 rs2162459 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布Table 2. The distribution of genetype and allele frequency of rs2162459

表3 rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性與基線血脂水平的關(guān)系Table 3. Association of rs2162459 polymorphism with the baseline lipid levels(Mean±SD)

5 Logistic 回歸分析rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性與阿托伐他汀降脂療效的關(guān)系

為研究CYP7A1 基因多態(tài)性與血脂療效的關(guān)系，我們按照不同的遺傳模式分別構(gòu)建了rs2162459 位點(diǎn)的廣義模型、加性模型、顯性模型和隱性模型，并根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法構(gòu)建了基本模型、年齡調(diào)整模型和多因素調(diào)整模型。

表4 表示rs2162459 位點(diǎn)不同遺傳模式下HDLC 調(diào)脂療效的logistic 回歸分析，經(jīng)過多元校正后3種模型的結(jié)果分別為:OR =1. 74，95% CI:1. 09 ～2.77;OR =2. 86，95%CI:1. 13 ～7. 25;OR =2. 21，95%CI:1.12 ～4.33。以上結(jié)果均提示等位基因G和基因型GG 與阿托伐他汀的升HDL-C 作用有關(guān)。

表4 rs2162459 位點(diǎn)不同遺傳模式下阿托伐他汀升高HDL-C 作用的logistic 回歸分析Table 4. Logistic regression analysis of HDL-C-elevating effect of atorvastation at rs2162459 locus in different genetic models

討 論

他汀類藥物通過特異性抑制膽固醇合成酶降低血液中的LDL-C、TG、TC 以及升高HDL-C，從而調(diào)節(jié)血脂，但是他汀類降脂療效會(huì)在很大范圍內(nèi)波動(dòng)。目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到藥物療效除了與年齡、性別和飲食等環(huán)境因素有關(guān)外，還受藥物基因控制的藥物代謝、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物受體及藥物作用靶點(diǎn)［2］的基因多態(tài)性的影響。

CYP7A1 基因位于8 號(hào)染色體長(zhǎng)臂(8q11 ～q12)，長(zhǎng)度10 kb，有6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子組成。膽固醇7α-羥化酶是肝內(nèi)膽汁酸合成的限速酶，CYP7A1 基因的變異可致膽固醇和膽汁酸代謝的障礙。CYP7A1 第6 外顯子純合子1302 ～1303TT 的缺失突變引起了L413FsX 框架位移，并造成膽固醇7α-羥化酶的缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致高膽固醇血癥［10］;另有小鼠實(shí)驗(yàn)表明CYP7A1 的過度表達(dá)可以避免高脂飲食引起的高膽固醇血癥、肥胖及胰島素抵抗［11］?，F(xiàn)在的研究主要集中在CYP7A1 基因啟動(dòng)子區(qū)域A-278C 的單核苷酸多態(tài)性。Wang 等［12］最先發(fā)現(xiàn)CYP7A1 的啟動(dòng)子區(qū)域A-278C 位點(diǎn)純合子基因型CC 與LDL-C 的高濃度有關(guān);隨后Kajinami 等［13］在324 例高脂血癥患者中研究發(fā)現(xiàn)CYP7A1 的A-204C位點(diǎn)處，當(dāng)個(gè)體的基因型發(fā)生CC→AC→AA 變化時(shí)LDL-C 下降的水平逐漸增大(P ＜0.05)，但后續(xù)的研究結(jié)果并不完全一致。

我們的研究位點(diǎn)rs2162459 位于CYP7A1 基因的第1 內(nèi)含子區(qū)域，采用multiplex SNaPshot 對(duì)rs2162459 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，等位基因A 和G 的頻率分別是48%和52%，接近HapMap 中報(bào)告的中國(guó)人的頻率43.3%和56.7%。在4 種血脂指標(biāo)的有效組和無效組基因型頻率和等位基因頻率的比較中，發(fā)現(xiàn)HDL-C 的基因型和等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＜0.05)。在rs2162459 位點(diǎn)基因多態(tài)性和臨床生化指標(biāo)的關(guān)系中，我們發(fā)現(xiàn)AA、GA和GG 基因型個(gè)體的基線HDL-C 水平依次降低(P ＜0.05)，提示基因型GG 和低基線HDL-C 水平有一定關(guān)系。

本研究在rs2162459 位點(diǎn)多態(tài)性和阿托伐他汀降脂療效的logistic 回歸分析中發(fā)現(xiàn)基因型GG 攜帶者與AA 攜帶者相比，升高HDL-C 的效果更明顯。經(jīng)過年齡、性別、吸煙和飲酒的多因素校正后，加性模型中ORG/A=1.74，95%CI:1.09 ～2.77;在廣義遺傳模型比較中ORGG/AA=2.86，95%CI:1.13 ～7.25;在顯性模型比較中，ORGG/AA+GA=2.21，95%CI:1.12～4.33，提示基因型GG 與阿托伐他汀升高HDL-C的療效相關(guān)。

綜上所述，rs2162459 位點(diǎn)的基因多態(tài)性與阿托伐他汀的降脂療效可能有一定的關(guān)系。另外該位點(diǎn)位于基因的非編碼區(qū)，只能引起表達(dá)調(diào)控和表達(dá)水平的改變，但由于血脂水平的異常受多基因和多個(gè)環(huán)境因素水平的影響，單一基因的作用或許微不足道。我們期待大樣本、多基因的研究深入探討基因多態(tài)性與他汀類降脂療效的關(guān)系，為臨床個(gè)體化用藥方案提供分子理論依據(jù)。

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