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      不同濃度超順磁性氧化鐵納米粒子對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響

      2013-12-23 03:50:40韓莎莎李俊峽
      關(guān)鍵詞:含鐵光纖硬化

      韓莎莎,李俊峽

      越來越多的研究表明,急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)的發(fā)生與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),斑塊脂質(zhì)中心越大,纖維帽中的炎細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)越多,斑塊越不穩(wěn)定,越容易破裂而導(dǎo)致ACS的發(fā)生[1,2]。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)作為一種磁共振對(duì)比劑,能被血液中的吞噬細(xì)胞特異性吞噬而標(biāo)記吞噬細(xì)胞,標(biāo)記后的吞噬細(xì)胞可以游走到炎癥所在部位并聚集,在磁共振掃描時(shí),造成炎癥所在部位的T2弛豫時(shí)間縮短,信號(hào)減低。因此可采用SPIO增強(qiáng)磁共振顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)早期診斷及評(píng)估AS斑塊的穩(wěn)定性。隨著SPIO濃度的升高,巨噬細(xì)胞的標(biāo)記率提高,但是高濃度的SPIO對(duì)巨噬細(xì)胞有毒性作用。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的SPIO標(biāo)記小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,通過檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記率、細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞吞噬功能來評(píng)價(jià)SPIO標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞的最適濃度。

      1 資料與方法

      1.1 細(xì)胞與試劑 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶/EDTA混合液為Hyclone產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為Gibcol產(chǎn)品;超順磁性氧化鐵(SHU555)(商品名Resovest)為德國(guó)Sehering公司產(chǎn)品,為荷蘭鹿特丹Erasmus大學(xué)醫(yī)學(xué)中心放射線科張卓立博士后提供;二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產(chǎn)品;四唑鹽(MTT)為Biosharp公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Hereaus公司產(chǎn)品;CA950-2型超凈臺(tái)為上海凈化儀器廠生產(chǎn);倒置相差顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃,5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng),當(dāng)RAW264.7巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)到80%左右融合時(shí),0.25%胰酶加EDTA混合液消化細(xì)胞,5min左右加入FBS終止消化,再加入DMEM培養(yǎng)基8ml左右,吹打細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,按1:1傳代。

      1.2.2 SPIO標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞 將RAW264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,以每孔2.5×105cells接種于內(nèi)置蓋玻片的6孔板中,加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,依次向各孔中加入含有SPIO的鐵濃度為14 μg/ml、28 μg/ml、56 μg/ml、84 μg/ml的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,另設(shè)1未加SPIO的樣品孔作為空白對(duì)照。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察SPIO在細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記率,每個(gè)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)2個(gè)視野,每個(gè)視野至少100個(gè)細(xì)胞。再將SPIO濃度擴(kuò)大10倍(即140 μg/ml、280 μg/ml、560 μg/ml、840 μg/ml)重復(fù)上述步驟。

      將式(3)、(9)代入式(10)、(11)可得空間光到少模光纖耦合效率隨橫向偏移rb的變化曲線.由于兩模光纖的模場(chǎng)面積較單模光纖大,且支持三個(gè)模式的模場(chǎng)傳輸,當(dāng)聚焦光斑發(fā)生橫向偏移時(shí),兩模光纖的LP11a模和LP11b模也會(huì)接收到信號(hào)光,少模光纖接收到的光能量要高于單模光纖,能夠獲得更高的耦合效率,因此少模光纖對(duì)光斑橫向偏移的容忍度更高.

      1.2.5 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞以每孔104的相同細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每一濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后,倒掉舊培養(yǎng)基,以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h,PBS洗滌3次,每孔加入0.7%的中性紅溶液100μl,繼續(xù)培養(yǎng)3h,棄去中性紅,PBS洗滌3次,吸干,加入細(xì)胞裂解液(冰醋酸:無水乙醇=1:1)150 μl,4℃過夜,用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光光度值。

      2.2 細(xì)胞活性

      鬼算盤錢通,年約四十,暗紫色長(zhǎng)衫,外罩藏青色馬褂,清瘦,一副大眾面孔,那怕你和他多次見面也不會(huì)留下絲毫印象;

      (4)缺乏培養(yǎng)新型人才的實(shí)踐環(huán)境。新時(shí)期新型人才的培養(yǎng)更加重視理論與實(shí)踐的結(jié)合,對(duì)于實(shí)踐環(huán)境的要求也更高。當(dāng)前,很多高校的理論課程內(nèi)實(shí)驗(yàn)或設(shè)計(jì)在計(jì)算機(jī)機(jī)房或者實(shí)驗(yàn)室就可以很好地完成。但是,這些實(shí)踐環(huán)境不能滿足企業(yè)的要求,需要和企業(yè)進(jìn)行更為緊密的合作。

      1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn):消化收集常規(guī)培養(yǎng)的未標(biāo)記及含有SPIO的RAW264.7細(xì)胞懸液,并稀釋至106個(gè)/ml,取9滴細(xì)胞懸液移入小試管內(nèi),加入1滴0.4%的臺(tái)盼藍(lán),混勻,3分鐘內(nèi)在光鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,其中死細(xì)胞染成淡藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染,計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量?;罴?xì)胞率=(100-藍(lán)染細(xì)胞/100)×100%的公式計(jì)算活細(xì)胞百分率,重復(fù)測(cè)量3次。

      選取2018年1—10月在我院接受治療的60例急性單純性闌尾炎患者作為研究對(duì)象,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組,每組各30例。觀察組中,男17例,女13例;年齡12~79歲,平均年齡(34.86±3.92)歲;病程1~10 h,平均病程(4.06±1.33)h。對(duì)照組中,男16例,女14例;年齡19~75歲,平均年齡(35.08±3.14)歲;病程1~10 h,平均病程(4.12±1.27)h。兩組患者一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

      2 結(jié)果

      2.1 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 普魯士藍(lán)染色證實(shí)RAW264.7細(xì)胞漿內(nèi)有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒,大部分的鐵聚合物包繞在細(xì)胞核周圍,而細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞外則未檢測(cè)到(圖1)。SPIO的鐵濃度為84μg時(shí),標(biāo)記24小時(shí)細(xì)胞的標(biāo)記率達(dá)到100%(圖1b),以后隨SPIO濃度的增加細(xì)胞內(nèi)鐵含量增加,普魯士藍(lán)染色的顏色越來越深(圖1c~圖1f),而普魯士藍(lán)染色的色澤是由吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)鐵的含量所決定的。到280μg/ml時(shí),細(xì)胞吞噬鐵含量接近飽和,以后隨SPIO濃度增加,細(xì)胞內(nèi)鐵含量沒有增加,普魯士藍(lán)染色未見加深。

      1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn):將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以每孔103的相同細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每一時(shí)相每一組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔,24h后更換培養(yǎng)液,以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24h,PBS沖洗,每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清液,每孔加入150μlDMSO,振蕩10min,選擇490nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光度值(OD)。此后7天每天監(jiān)測(cè)并記錄細(xì)胞OD值,觀察細(xì)胞對(duì)不同標(biāo)記濃度的反應(yīng)。

      術(shù)后疼痛程度評(píng)分比較,觀察組VAS評(píng)分結(jié)果(3.05±1.00)分,與對(duì)照組評(píng)分結(jié)果(5.50±1.50)分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

      2.2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞被染成藍(lán)色而活細(xì)胞拒染(圖2),提示SPIO濃度對(duì)細(xì)胞活性有影響,進(jìn)一步行SNK多重比較檢驗(yàn)示SPIO濃度為560μg /ml和840μg /ml的兩組與其他組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,表1)。

      2.2.2 四唑鹽(MTT)比色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)MTT比色實(shí)驗(yàn)所得OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖3),當(dāng)SPIO含鐵濃度大于等于280μg /ml時(shí)細(xì)胞增殖受影響,與對(duì)照組及SPIO含鐵濃度小于280μg/ml各組生長(zhǎng)曲線相比差異較大,而對(duì)照組生長(zhǎng)曲線與SPIO含鐵濃度小于280μg /ml各組生長(zhǎng)曲線相比未見明顯差異。說明SPIO含鐵濃度大于140μg/ml時(shí)抑制RAW264.7細(xì)胞增殖。

      2.3 中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞核周圍及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見巨噬細(xì)胞吞噬的中性紅顆粒(圖4a),將中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)所得OD值繪成折線圖(圖4b),可見SPIO含鐵濃度小于等于280μg /ml時(shí),SPIO濃度與OD值成正比,當(dāng)SPIO濃度超過280μg/ml后OD值與SPIO濃度呈反比,說明SPIO含鐵濃度>280μg/ml時(shí),巨噬細(xì)胞的吞噬功能受到影響。

      3 討論

      圖1 普魯士藍(lán)染色結(jié)果 (SPIO的鐵濃度依次為:1a:28μg /ml,1b:84μg,1c:140μg /ml,1d:280μg /ml,1e:560μg /ml,1f:840μg /ml)

      表1 不同SPIO濃度下活細(xì)胞數(shù)

      圖2 細(xì)胞活性檢測(cè)(臺(tái)盼藍(lán)染色,箭頭所指處為藍(lán)染死細(xì)胞)

      圖3 MTT法檢測(cè)不同SPIO濃度標(biāo)記RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

      全球范圍內(nèi)心血管疾病的發(fā)病率逐年升高,其中動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。穩(wěn)定性的動(dòng)脈粥樣硬化主要以血管腔狹窄而造成的各種缺血癥狀為主,而易損斑塊則由于斑塊破裂、血栓形成而產(chǎn)生如心肌梗死、腦血管梗死等急性事件。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮損傷所做出的一系列慢性炎癥反應(yīng),其中巨噬細(xì)胞貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的全過程,與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[3-5]。

      圖4 吞噬功能檢測(cè)(4a:中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果,4b:細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)OD值曲線)

      馬占龍[5]等的研究證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中,巨噬細(xì)胞吞噬SPIO使大量納米鐵顆粒在斑塊局部聚集,進(jìn)而引起了MRI信號(hào)的改變,從而可實(shí)現(xiàn)粥樣斑塊活體檢測(cè)。Raynal等[6]實(shí)驗(yàn)表明,SPIO可通過巨噬細(xì)胞的“清道夫”受體(scavenger recep tors SR2A)被吞噬,而很少被內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞攝取[7-9]。這些研究提示通過巨噬細(xì)胞吞噬SPIO在磁共振下顯影可實(shí)現(xiàn)在體無創(chuàng)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)富含巨噬細(xì)胞的易損斑塊的病變發(fā)展,指導(dǎo)臨床治療及預(yù)防工作。但需要尋找合適的SPIO濃度,SPIO濃度過高會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用影響細(xì)胞功能及活性,SPIO過低則不能清晰顯影粥樣硬化斑塊。本實(shí)驗(yàn)主要通過不同濃度SPIO體外標(biāo)記RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞活性和標(biāo)記率的影響評(píng)估了體外標(biāo)記巨噬細(xì)胞的最適濃度。發(fā)現(xiàn)SPIO含鐵濃度84μg/ml即可達(dá)到巨噬細(xì)胞100%標(biāo)記,140μg/ml以下不影響細(xì)胞增殖,280μg/ml以下不影響細(xì)胞吞噬功能。對(duì)日后進(jìn)一步體內(nèi)及體外研究SPIO對(duì)巨噬細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的影響奠定了基礎(chǔ)。

      但是,本研究?jī)H從細(xì)胞活性和吞噬能力兩方面評(píng)價(jià)了不同濃度SPIO對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響,沒有對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行磁共振顯影,無法比較不同濃度SPIO標(biāo)記的RAW264.7細(xì)胞在磁共振下顯影的效果,也沒有通過電子顯微鏡觀察對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響,仍需后續(xù)進(jìn)一步研究。

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