大鼠非酒精性脂肪肝中UCP2動態(tài)表達研究

吳 瓊 夏 旋 鄒秀蘭

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 三峽大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北宜昌 443000

非酒精性脂肪肝，是一種無過度飲酒史，由于肝細胞內(nèi)脂肪存積或變性所導(dǎo)致的臨床病理綜合征。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對高脂肪類食物的攝入增多，非酒精性脂肪肝的發(fā)病幾率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，并最終發(fā)展成為終末期肝病或肝硬化，對患者健康和生活造成嚴重影響，且當前仍沒有有效的治療藥物[1]。解耦聯(lián)蛋白2（UCP2）是一種位于線粒體內(nèi)膜上的載體蛋白，具有解偶聯(lián)的作用，可以發(fā)揮脂質(zhì)調(diào)節(jié)的作用，但當UCP2的表達增加時，卻同時對機體產(chǎn)生不良的作用，在非酒精性脂肪肝的形成發(fā)展過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[2]。為了探討兩者之間的關(guān)系，本研究選取大鼠建立非酒精性脂肪肝模型實驗，對UCP2的動態(tài)表達變化進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本醫(yī)院動物中心的成年、雄性大鼠60只進行研究（合格證號：1003046），體重150～200g，首先全部采用普通飼料喂養(yǎng)1周。按照隨機分組原則將60只大鼠劃分為觀察組和對照組各30只。觀察組大鼠采用88%基礎(chǔ)飼料加10%豬油加2%膽固醇，自由進食和飲水；對照組采用普通飼料進行飼養(yǎng)，兩組患者均以12周為1個周期進行飼養(yǎng)[3]。采用分籠飼養(yǎng)的方式對兩組大鼠進行飼養(yǎng)，每個籠子6只。兩組大鼠分別于飼養(yǎng)2、4、6、8、12周腹腔注射2%戊巴比妥鈉1mg/kg進行麻醉，進行腹腔靜脈采血，12周時取出肝臟，常規(guī)制備血清，將肝臟組織在-70℃下進行低溫保存[4]。

1.2 檢測指標

采用免疫組織學(xué)技術(shù)和Western blot技術(shù)對大鼠肝組織中的UCP2進行檢測，對大鼠的血清甘油三脂（TG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和游離脂肪酸（FFA）含量進行檢測，按照儀器操作步驟進行檢測操作，并采用全自動生化分析儀進行檢測[5]。

1.3 方法

1.3.1 病理學(xué)檢測方法 取肝組織進行石蠟切片，進行常規(guī)PAS和HE染色處理，對肝細胞的脂肪性變程度進行觀察；對冰凍切片UCP2進行化學(xué)染色，其表達程度判斷標準為：1個加號表示肝小葉內(nèi)約1/3的陽性細胞染色，呈淺黃色；兩個加號表示肝組織內(nèi)約2/3的細胞陽性染色，呈棕黃色；3個加號表示肝小葉內(nèi)有超過2/3的細胞陽性染色，呈棕褐色[6]。

1.3.2 Western blot技術(shù) 取右肝組織200mg，加入含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，在4℃環(huán)境在采用1000r/8min離心機進行離心15min，取上清蛋白，取50μg蛋白變性，采用聚丙酰胺凝膠電泳法進行檢測，獲得6%脫脂奶粉在室溫下封閉1h，UCP2抗體，在4℃環(huán)境下進行過夜保存[7]。洗滌后加入辣根過氧化物酶結(jié)合抗免IgG，采用化學(xué)發(fā)光劑進行檢測，在X片下進行顯影。采用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)對帶積分灰度值進行定量分析，注意所測數(shù)據(jù)需要扣去背景積分光密度[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用t進行檢驗，計量資料采用（± s）進程表示，計數(shù)資料采用x2進行檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標檢測結(jié)果（表1）

表1 血清生化指標檢測指標變化（± s）

表1 血清生化指標檢測指標變化（± s）

注：觀察組與對照組相比較，P＜0.05

指標 組別 2周 4周 8周 12周TG（mmol/L） 觀察組 0.78±0.06 0.86±0.11 1.16±0.11 1.41±0.06對照組 0.72±0.05 0.73±0.02 0.74±0.02 0.75±0.05 FAA（μmol/L） 觀察組 371.3±13.6 439.2±1.42 486.3±13.5 636.7±20.4對照組 364.6±12.3 361.4±12.1 372.1±10.9 371.7±12.6 ALT（U/L） 觀察組 37.8±2.6 42.9±4.6 55.6±6.5 65.39±3.8對照組 37.6±2.5 38.2±2.6 40.2±4.6 42.9±5.6

2.2 肝組織病理學(xué)變化和免疫組織化學(xué)

在光鏡下進行觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠的肝組織病理學(xué)形態(tài)變化正常，觀察組大鼠肝組織出現(xiàn)不同程度變性，肝細胞體積增大，且與高脂肪飲食的時間長短呈正相關(guān)關(guān)系，在2、4、8、12周檢測結(jié)果不斷發(fā)展。對兩組大鼠進行免疫組織學(xué)習化學(xué)染色，對照組大鼠幾乎未見UCP2陽性肝細胞，高脂飲食觀察組大鼠的肝組織中UCP2的分布則較廣，主要位于細胞漿中，其分布與肝組織脂肪化的程度呈正相關(guān)關(guān)系[9]。見圖1。

圖1 觀察組與對照組染色結(jié)果對比

2.3 Western blot技術(shù)檢驗結(jié)果

對照組呈陰性表達，觀察組灰度不斷加深，表明脂肪肝程度加重，UCP2表達逐漸增強。見圖2。

圖2 觀察組Western blot技術(shù)檢驗結(jié)果

3 討論

解耦聯(lián)蛋白是位于線粒體膜上的蛋白質(zhì)，能夠促進線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體合成ATP的效率降低，以熱能形式對體內(nèi)能量進行釋放，對線粒體的能力儲備具有調(diào)節(jié)作用[10]。UCP2是解耦聯(lián)蛋白的一種，在線粒體內(nèi)膜上起到質(zhì)子通道的作用，在正常的肝組織中，UCP2只存在于庫普夫細胞進行表達，在肝細胞中的表達水平很低甚至直接不進行表達。當肝組織受到肥胖、多脂多糖刺激、內(nèi)毒素、游離脂肪酸、活性氧、胰島素、脂質(zhì)過氧化物、瘦素等因子誘導(dǎo)時，會出現(xiàn)UCP2在肝細胞中的表達，產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，表達增強，降低肝細胞氧化物產(chǎn)生ATP的效率，阻止脂質(zhì)物質(zhì)在肝組織進行沉積，預(yù)防脂肪肝形成，利于肥胖型脂肪肝患者對肝細胞的能力需求進行平衡[11]。此外，UCP2還具有其他多種作用：調(diào)節(jié)脂肪酸的β氧化，促進脂肪酸在肝組織內(nèi)的跨膜運轉(zhuǎn)，促進線粒體氧化利用脂肪酸，減少脂質(zhì)沉積；介導(dǎo)質(zhì)子的跨膜內(nèi)流，降低線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)梯度，降低線粒體合成ATP的能力；線粒體能量分解增加，儲備降低，導(dǎo)致肝組織細胞易壞死，肝細胞被脂肪化性變時產(chǎn)生的底物為UCP2的產(chǎn)生提供更多易于被氧化的LPO和ROS等，UCP2表達進一步增強，導(dǎo)致肝組織出現(xiàn)細胞壞死。在脂肪肝的形成過程中，UCP2表達的動態(tài)變化是一把雙刃劍，它一方面是肝組織做出的適應(yīng)性反應(yīng)，降低脂質(zhì)在肝組織的沉積；另一方面，由于脂質(zhì)過度分解，能量儲備降低，使得肝細胞的耐受性降低，受到缺血再灌注、禁食或果糖應(yīng)激注射等二次刺激時容易出現(xiàn)肝細胞壞死，對脂肪肝炎和肝纖維化的抵抗能力進一步降低[12]。

本組采用大鼠建立脂肪肝模型，發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)組大鼠在脂肪肝形成過程中，體內(nèi)UCP2陽性細胞的表達強度和血清中TG、FAA、ALT等含量均隨著脂肪肝形成過程升高，在8～12周表現(xiàn)最為顯著。非酒精性脂肪肝在形成過程中，脂肪肝程度不斷發(fā)展，導(dǎo)致對肝細胞和肝功能造成損傷，脂質(zhì)組織的過氧化反應(yīng)不斷增強，UCP2的活性表達也明顯增強，與脂肪肝所引起的肝組織損傷程度密切相關(guān)。

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