鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠改善大鼠實驗性牙周炎的作用評價

劉迪　楊丕山　胡德渝等

[摘要] 目的 在動物體內檢驗鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠的生物相容性及其對牙周炎動物模型的修復效果。方法 毒性實驗：用質量分數2%鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠溶液給SD大鼠灌胃，觀察長期應用該制劑有無全身不良反應及其反應程度。牙周炎動物模型實驗：將實驗性牙周炎建模成功的SD大鼠分為3 組，A組為派麗奧組，B組為實驗藥物組，C組為陰性對照組；A、B組每周牙周袋內給藥1次，連續(xù)56 d，C組給予生理鹽水；分別在給藥7、14、28、56 d后測量各組動物的牙周探診深度（PD）和牙齦指數（GI），并進行組織學觀察，計算單核細胞和破骨細胞的數目。結果 鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠具有良好的生物相容性；給藥14 d后，PD、GI，以及單核細胞和破骨細胞數目均較其他兩組明顯降低，組織學觀察可見新骨及部分新纖維形成。結論 牙周袋內使用鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠可減輕牙周炎癥，提示該制劑對改善牙周炎有一定的療效，具有臨床應用前景。

[關鍵詞] 脂質體； 鹽酸米諾環(huán)素； 實驗性牙周炎； 動物模型

[中圖分類號] R 781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.012

四環(huán)素族藥物是治療牙周病的代表藥物。治療牙周病時，如果采用全身用藥，具有給藥劑量大，易產生耐藥性等缺點，且局部療效并不令人滿意；隨著小劑量四環(huán)素類藥物具有調節(jié)宿主免疫反應這一新的作用機制的發(fā)現，各國學者都在積極探索新的給藥方法或進行新劑型的開發(fā)，已經取得了較大的進展。

四環(huán)素類藥物局部給藥的重要進展是控、緩釋劑型的應用，如四環(huán)素纖維棒、多西環(huán)素凝膠、米諾環(huán)素微球等。這種劑型的優(yōu)點是置入牙周袋內后，藥物能緩慢持久地釋放，從而達到持續(xù)抗菌和有效改善牙周組織的作用，且某些緩釋材料可被局部組織吸收，使用方便；可減少給藥次數，平均每周給藥1次，提高患者的依從性[1]。任蕾等[2]的研究顯示，米諾環(huán)素對牙周主要致病菌的抑菌效果較好，其抗菌譜較其他藥物更為理想，可作為牙周炎急性發(fā)作時的首選藥物。

脂質體作為一種藥物載體，其組成和結構與細胞膜十分相似，滲透力強，能穿透上皮屏障，對網織內皮系統(tǒng)具有趨向性，易被吞噬細胞攝取而實現細胞內給藥，提高了藥物的生物利用度，減少了給藥劑量，可以減輕甚至避免藥物的不良反應[3]。本研究通過動物實驗檢驗一種新型鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠的生物相容性及其對動物牙周損傷模型修復的效果，為其在牙周病治療中的應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗設備和材料

無齲壞及牙周病的5周齡SD大鼠（四川大學華西動物實驗中心）；牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室）；質量分數2%（每克含20 mg鹽酸米諾環(huán)素脂質體）鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠（四川大學華西藥學院藥劑學實驗室）；2%（每克含20 mg鹽酸米諾環(huán)素）鹽酸米諾環(huán)素軟膏派麗奧。

1.2 鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠對大鼠的全身毒

性實驗

健康SD大鼠20只，實驗組和對照組各10只，雌雄各半。實驗組：2%鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠用雙蒸水配制成2%樣品水溶液；對照組：雙蒸水；以每天5 mL·kg-1的劑量連續(xù)灌胃，30 d后觀察2組大鼠的體重變化及臨床毒性體征。將灌胃大鼠的肝臟、腎臟組織取出，觀察組織病理學變化，評價其組織相容性。

1.3 鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠對大鼠實驗性牙

周炎的影響

1.3.1 大鼠實驗性牙周炎模型的建立 選擇雌性SD大鼠建立牙周炎動物模型。以10%水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，然后用直徑0.2 mm正畸鋼絲在左上頜第一磨牙靠近牙齦根方做牙頸部結扎1周，在腭側近中打結，結扎后在齦溝內接種牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277，配10%葡萄糖水喂食[4]。建模后21 d測量牙周探診深度（probing depth，PD）、牙齦指數（gingival index，GI），制作左上頜第一磨牙及牙周組織切片，通過蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色法處理后，光學顯微鏡下觀察牙周組織的病理學變化。

1.3.2 實驗分組及檢測方法 建模成功的78只大鼠，體重（172.5±10.2）g，將其中的72只大鼠（另外6只因操作不當不適于進行下一步實驗而被排除）按GI、PD值均衡分成3組，給予不同的藥物治療：A組為陽性對照組，使用派麗奧；B組為實驗組，使用2%鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠；C組為陰性對照組，使用0.9%生理鹽水。每組有24只大鼠，分別觀察7、14、28、56 d，每個時間段每組檢查6只大鼠，檢測牙位為左上頜第一磨牙。每組每周牙周袋內給藥1次，用藥前用探針機械清理牙面，將藥物注入牙周袋內。分別在給藥7、14、28、56 d后測量每只動物左上頜第一磨牙的PD和GI，每組分別處死6只動物進行單核細胞和破骨細胞計數，并行組織學觀察。

2 結果

2.1 鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠的全身毒性

連續(xù)灌胃30 d后，對照組和實驗組的體重相對增長率分別為27%和29%，2組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。實驗組大鼠的肝臟、腎臟組織切片正常，未發(fā)現結構破壞和毒性物質沉積，提示該藥物在機體內無毒性作用。

2.2 建模效果評價

建模21 d，分別觀察78只大鼠左上頜第一磨牙，共計78顆牙。肉眼觀察可見：牙齦紅腫，第一、二磨牙間牙齦乳頭紅腫。GI分級平均為3，探及牙周袋；PD均值為1.59 mm。處死6只大鼠，觀察牙周組織的病理學變化，結果見圖 1：牙齦組織有大量單核細胞浸潤，結合上皮根向增殖，形成牙周袋；牙周袋內上皮糜爛，可見細菌團塊；牙周纖維有大量炎癥細胞浸潤，細胞變性水腫，纖維排列紊亂，甚至斷裂；有較多破骨細胞及吸收陷窩，牙槽嵴頂有明顯吸收。

2.3 GI和PD測量結果

不同觀察時間3組大鼠左上頜第一磨牙GI和PD的測量結果見表1。給藥7 d時，A、B組大鼠左上頜第一磨牙的GI與基線相比較均降低，B組較A組更為明顯；A、B組的PD與基線相比，其差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。給藥14 d時，與C組比較，A、B組的GI均有明顯降低；A組和C組PD的差異無統(tǒng)計學意義，而B組的PD明顯低于A、C組（P<0.05）。給藥28 d和56 d時，A、B組的GI、PD均有明顯降低，2組PD均明顯低于C組（P<0.05），其中B組的PD降低更明顯，與A組比較其差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.4 組織學觀察結果

2.4.1 單核細胞和破骨細胞計數結果 選擇包埋較好的3個蠟塊，每個蠟塊選取1張包含3個磨牙在內的組織切片，在顯微鏡下連續(xù)攝取4張矩形數碼照片，手工選出單核細胞及破骨細胞并計數，其結果見表2。給藥7 d時，A、B組單核細胞和破骨細胞數目與C組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），A、B組間也無明顯差別（P>0.05）。給藥14、28、56 d時，A、B組單核細胞和破骨細胞數量均明顯低于C組（P<

0.05），B組單核細胞和破骨細胞數量減少得更明顯，與A組比較也有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

2.4.2 組織學觀察結果 3組牙齒的組織學觀察結果見圖2。給藥7 d時，A、B組牙周纖維可見炎癥細胞浸潤，有少量破骨細胞，牙槽骨未見明顯吸收；C組有大量炎癥細胞浸潤，破骨細胞活躍。給藥14、28 d時，A組結合上皮的位置向冠方移動，未見新纖維形成；B組結合上皮的位置向冠方移動，可見少量新纖維生成，未見新骨形成；C組結合上皮內有大量炎癥細胞浸潤，繼續(xù)向根方增殖，牙槽嵴頂吸收至根尖1/3。給藥56 d時，A組可見新纖維形成，未見明顯的新骨形成；B組可見大量新纖維形成，并有新生牙槽骨組織形成；C組牙周纖維排列紊亂、有斷裂，牙槽嵴頂繼續(xù)向根方吸收。

3 討論

牙周疾病是危害人類牙齒和全身健康的主要口腔疾病。四環(huán)素類藥物能夠調節(jié)宿主免疫反應，有效改善各項牙周指數，提高牙周炎治療的成功率。應用脂質體作為藥物載體，可使藥物更具滲透力，實現細胞內給藥，提高藥物的生物利用度。

采用本課題組研制的鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠新制劑水溶液給SD大鼠灌胃，發(fā)現該制劑對大鼠體重的增長無明顯影響，肝臟、腎臟組織切片正常，未發(fā)現組織細胞結構破壞和毒性物質沉積，提示該制劑在機體內無長期毒性作用，具有較好的組織相容性和安全性，初步顯示了良好的應用前景。為了進一步驗證鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠臨床應用的可行性，本實驗建立了SD 大鼠牙周炎動物模型進行研究。牙齦的炎癥和牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改變。GI可以反映牙齦炎癥的程度，而PD是牙周病最重要的檢查方法，本實驗中采用GI和PD以及組織學觀察共同評價藥物的作用效果。鹽酸米諾環(huán)素可通過與膠原酶活化所必須的金屬陽離子Ca2+、Zn2+螯合來抑制中性粒細胞，并可誘導成熟破骨細胞的凋亡，抑制破骨細胞的生成，還可增強Ⅰ型膠原纖維的合成，穩(wěn)定膠原基質為成骨細胞的分化提供重要場所，促進成骨[5-7]。通過組織病理切片觀察單核細胞及破骨細胞的數量變化判定炎癥轉歸，以及牙槽嵴改建情況是非?？煽康姆椒?，這樣得到的實驗結果可信度高。

抑菌作用是鹽酸米諾環(huán)素在牙周炎治療中發(fā)揮的主要作用之一。以往的研究[8]發(fā)現，鹽酸米諾環(huán)素對一系列牙周致病菌包牙齦擬桿菌、中間普雷沃菌、嚙蝕艾肯菌、具核梭桿菌的90%最小抑菌濃度分別為0.1、0.39、0.39、0.78 ?g·mL-1。鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠的有效藥物質量分數為2%，可充分發(fā)揮其抑菌作用。本實驗中，陽性對照組選擇2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏派麗奧，是目前已經廣泛應用于臨床的緩釋抗菌藥物[9-10]。緩釋制劑的特點是能提高牙周袋內鹽酸米諾環(huán)素的濃度，但藥物釋放速度不恒定，通常在其置入袋內2～3 d內釋放出80%～90%的鹽酸米諾環(huán)素，隨后釋放速度變慢，藥物濃度明顯下降，牙周袋內藥物濃度波動較大[8]。在鹽酸米諾環(huán)素控釋脂質體前期對巨噬細胞作用的研究[11]中發(fā)現，該藥物與派麗奧比較能夠勻速釋放藥物，恒定持續(xù)地抑制腫瘤壞死因子α的產生，發(fā)揮控釋作用；而派麗奧則通過波動性持續(xù)抑制而發(fā)揮緩釋作用。本藥物的控釋作用可使鹽酸米諾環(huán)素在預定時間內自動按某一速度從劑型中以恒定的速度釋放于牙周袋內，使牙周袋內的藥物濃度在較長時間內恒定地維持在有效范圍內，延長有效作用時間[12]。脂質體具有控釋作用主要是由于其提供了外源性雙層膜，使角質層細胞間結構改變，脂質雙分子層疏水性尾部排列紊亂，藥物可通過擴散和毛細管作用進入細胞間隙，使角質層濕化和水合作用增強；脂質體磷脂與角質層脂質融合后，被細胞內的溶酶體所破壞，使藥物勻速釋放[13]。

本研究中，給藥7 d后，A、B組各項指標僅略微下降，與C組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），這可能是因為大鼠牙周破壞嚴重，給藥時間短，已破壞的牙周組織還未完全修復所致。實驗期內，實驗藥物組（B組）牙周炎開始改善的時間早于A組，在已經觀察的2個月內，實驗藥物顯示出更好的抗炎作用，這跟兩組藥物劑型不同有關。脂質體由磷脂雙分子層包覆水相囊泡構成，生物相容性好，對所載藥物有廣泛的適應性，水溶性藥物載入內水相，脂溶性藥物溶于脂膜內，兩親性藥物可插于脂膜上[14]；磷脂本身是細胞膜成分，注入體內無毒，生物利用度高，且不引起免疫反應；脂質體還能保護所載的藥物，防止體液對藥物的稀釋和被體內的酶分解破壞[15]。本研究證明，2%鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠改善大鼠實驗性牙周炎的效果優(yōu)于派麗奧。

本研究結果提示：鹽酸米諾環(huán)素脂質體控釋凝膠能夠改善牙周組織病變，抑制單核細胞和破骨細胞數量的增加，改善牙齦炎癥和牙周袋深度，并可促進新牙周纖維及新骨的生成；這為該凝膠治療牙周病提供了初步的實驗依據，也證明其具有臨床應用前景。

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（本文編輯 吳愛華）