外源SNP對(duì)低溫下馬鈴薯試管苗相關(guān)酶活性的影響

吳雁斌，王一航，胡新元，文國(guó)宏，李高峰，鄭永偉，張 榮，李建武，閻耀廷

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省慶陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，甘肅慶陽(yáng) 745000）

低溫會(huì)誘導(dǎo)植物小分子抗性物質(zhì)的積累和抗氧化酶類(lèi)活化，最終緩解低溫脅迫造成的機(jī)械和生理傷害，鍛煉植物抗性［1］。氧化還原信號(hào)分子一氧化氮（NO）參與植物生理代謝過(guò)程，并對(duì)諸如植物的呼吸作用、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、根和葉片的生長(zhǎng)發(fā)育、果實(shí)等植物組織的成熟和衰老、脅迫響應(yīng)、逆境誘發(fā)的細(xì)胞程序性死亡等生理過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用，是一種重要的第二信使［2～3］。適當(dāng)濃度的一氧化氮可通過(guò)反饋調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的硝酸還原酶（NR）活性調(diào)節(jié)植物氮代謝產(chǎn)物，降低膜脂過(guò)氧化作用，和細(xì)胞中活性氧自由基，減緩衰老，提高植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力［4～5］。低濃度的一氧化氮供體硝普鈉（SNP）可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但高濃度的SNP卻會(huì)產(chǎn)生毒害，嚴(yán)重時(shí)造成植株死亡［6］?；谝陨显颍覀円愿拭C省馬鈴薯主栽品種隴薯3號(hào)、隴薯6號(hào)脫毒試管苗為研究對(duì)象，測(cè)定了SNP對(duì)低溫脅迫下馬鈴薯試管苗的相關(guān)生理指標(biāo)的影響，以期為解決馬鈴薯生產(chǎn)中遇到的低溫脅迫問(wèn)題提供理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

NO供體硝普鈉（SNP）為Sigma公司生產(chǎn)。先用ddH2O配制成100mmol/L的母液，4℃下保存，用時(shí)按照需要進(jìn)行稀釋。隴薯3號(hào)、隴薯6號(hào)試管苗由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)已有的方法建立供試馬鈴薯試管苗擴(kuò)繁體系［7］?；A(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，SNP濃度梯度為0（CK）、0.05、0.10mmol/L。在無(wú)菌條件下，分別將生長(zhǎng)25 d的隴薯3號(hào)、隴薯6號(hào)脫毒試管苗接種于培養(yǎng)基中，各SNP濃度處理下每品種1瓶，3次重復(fù)。接種后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)（溫度4℃，光照2 500 Lx、24 h/d） 培養(yǎng)，株高4 cm后開(kāi)始測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)，每隔7 d測(cè)定1次，共測(cè)定5次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酶液的制備 取0.2 g新鮮馬鈴薯組培苗組織，加少許石英砂和5mL預(yù)冷酶提取液（用pH 7.8的磷酸緩沖液配制，含EDTA 5 mmol/L、AsA 2 mmol/L、PVP 2%）于冰浴研缽中，迅速勻漿后在4℃、4 000 r/min下離心15min，取上清液待用。

1.3.2 抗氧化酶活性的測(cè)定 POD活性采用0.3%愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［8］；SOD活性采用NBT光還原法測(cè)定，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光照下被還原到50%的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）［9］；CAT活性采用240 nm比色法測(cè)定［9］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果分析

2.1 外源SNP處理對(duì)低溫下隴薯3號(hào)試管苗SOD、POD、CAT活性的影響

SOD是需氧生物細(xì)胞中普遍存在的一類(lèi)金屬酶，它能催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng)生成O2和H2O2；CAT與POD是清除H2O2過(guò)程的關(guān)鍵性酶，其中POD是植物體中的重要葉綠體保護(hù)酶，葉綠體POD作用于米勒反應(yīng)中產(chǎn)生的H2O2，而CAT主要清除光呼吸產(chǎn)生的H2O2。低溫可使植物體內(nèi)活性氧逐步累積并超過(guò)傷害閥值，提高植物清除活性氧的能力可減輕低溫傷害［10］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在4℃低溫條件下，在MS培養(yǎng)基中添加0.05、0.10mmol/LSNP處理的隴薯3號(hào)試管苗均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

由表1可見(jiàn)，在4℃低溫條件下，在MS培養(yǎng)基中分別添加0.05、0.10mmol/LSNP后，隴薯3號(hào)試管苗的SOD活性除第5次測(cè)定值明顯低于同期不添加SNP處理（CK）外，其余4次測(cè)定值均高于同期對(duì)照，且添加0.05mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均高于同期添加0.10mmol/LSNP處理。POD活性除添加0.10mmol/LSNP處理第2次的測(cè)定值稍低于同期對(duì)照外，其余測(cè)定值均高于同期對(duì)照，且添加0.05 mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均高于同期添加0.10 mmol/LSNP處理。CAT活性添加0.05mmol/LSNP處理、0.10mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均高于同期對(duì)照，其中添加0.05mmol/LSNP處理的第1次測(cè)定值高于添加0.10mmol/LSNP處理，其余4次測(cè)定值均低于同期添加0.10mmol/LSNP處理。

表1 低溫下不同濃度SNP處理的隴薯3號(hào)試管苗

2.2 外源SNP處理對(duì)低溫下隴薯6號(hào)試管苗SOD、POD、CAT活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，在4℃低溫條件下，在MS培養(yǎng)基中添加0.05、0.10mmol/LSNP處理的隴薯6號(hào)試管苗均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。由表2可見(jiàn)，在4℃低溫條件下，在MS培養(yǎng)基中分別添加0.05、0.10 mmol/L SNP后，隴薯6號(hào)試管苗的SOD活性添加0.05mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均高于同期不添加SNP處理（CK），添加0.10mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均低于同期對(duì)照。POD活性除添加0.05 mmol/LSNP處理的第5次測(cè)定值低于同期對(duì)照外，其余測(cè)定值均高于同期對(duì)照，且添加0.05mmol/L SNP處理除第5次測(cè)定值低于同期添加0.10mmol/L SNP處理外，其余4次均高于同期添加0.10mmol/L SNP處理。CAT活性添加0.05 mmol/LSNP處理、0.10mmol/LSNP處理的5次測(cè)定值均高于同期對(duì)照，且添加0.05mmol/LSNP處理除第5次測(cè)定值與同期添加0.10mmol/LSNP處理相等外，其余4次均高于同期添加0.10mmol/LSNP處理。

表2 低溫下不同濃度SNP處理的隴薯6號(hào)試管苗

3 小結(jié)與討論

1） 在4℃低溫條件下，在MS培養(yǎng)基中分別添加0.05、0.10mmol/LSNP后，隴薯3號(hào)、隴薯6號(hào)試管苗的SOD、POD、CAT活性均有所提高，即低溫脅迫對(duì)馬鈴薯試管苗細(xì)胞的氧化損傷度減輕，細(xì)胞修復(fù)速度加快。SNP濃度以0.05mmol/L最佳。

2）已有的試驗(yàn)表明，SNP處理可減輕低溫脅迫對(duì)黑麥草（Lolium perenne）細(xì)胞的氧化損傷度，加快細(xì)胞修復(fù)［11］，本試驗(yàn)結(jié)果與此相符。在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，0.05mmol/LSNP對(duì)緩解馬鈴薯試管苗遭受低溫脅迫的效果較佳，但此結(jié)論還需要進(jìn)一步研究，以便深入了解SNP緩解低溫脅迫的根本原因。

［1］ 曾乃燕，何軍賢，趙 文，等.低溫脅迫期間水稻光合膜色素與蛋白水平的變化［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2000，20（l）：8-14.

［2］ BELIGNIM V，LAMATTINA L.Nitric oxide stimulates seed germination and de-etiolation，and inhibitshypocotyls elongation，three light-inducible responses in plants［J］.Planta，2000，210（2）：215-222.

［3］ CHUNG H T，PAE H O，CHOIB M，et al.Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis［J］.Biochem Biophys Res.Commun，2001（282）：1075-1079.

［4］ YAMASAKIH，SHANIOHIS Y，TAKAHASHIS.An alternative pathway for nitric oxide production in plant：new feature of an old enzyme ［J］.Trends plant Sci.，1999，4（4）：128-129.

［5］ BELIGNIM V，LAMATTINA L.Nitric oxide counteracts cyto toxic processesmediated by Re-active oxygen species in plant tissues［J］.Planta，1999，208（6）：337-344.

［6］ BELIGNIM V，LAMATTINA L.Is nitric oxide toxic or protective［J］.Trends PlantSci.，1999，4（8）：299-300.

［7］ 裴懷弟，陳玉梁，王紅梅，等.馬鈴薯試管苗耐鹽性研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2011（6）：10-14.

［8］ 孫 群，胡景江．植物生理學(xué)研究技術(shù)［M］.西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2006.

［9］ 鄒 琦．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［10］ 王建華，劉鴻先，徐 同．超氧物歧化酶（SOD）在植物逆境和衰老生理中的作用［J］.植物生理學(xué)通訊，1989，82（1）：1-7.

［11］ 馬向麗，魏小紅，龍瑞軍，等．外源一氧化氮提高一年生黑麥草抗冷性機(jī)制［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25（6）：1269-1274.