軟鰭新光唇魚（Neolissochilus benasi）的人工繁殖與胚胎發(fā)育

潘曉賦，劉 倩，王曉愛，楊君興 ，陳小勇，李再云，李 列

1. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室，云南 昆明 650223

2. 中國科學院大學，北京 1000493

3. 西疇縣經(jīng)濟商務局，云南 西疇 663500

胚胎和仔魚畸形是水產(chǎn)業(yè)最為嚴重的問題之一,制定魚類精卵質(zhì)量評價體系,降低胚胎發(fā)育及仔稚魚外部畸形是以放流為目的的魚苗生產(chǎn)質(zhì)量控制和研究的重要環(huán)節(jié)（Vay et al,2007；Yang et al,2013）。在傳統(tǒng)漁業(yè)生產(chǎn)中, 仔稚魚質(zhì)量關(guān)乎水產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量, 在長期實踐中雖已發(fā)展出了眾多提高其質(zhì)量的技術(shù), 但效果不佳, 畸形率仍居高不下,影響其放流后生存能力（Tsukamoto et al, 1997）。造成畸形的原因很多, 如環(huán)境（溫度、光照和鹽度等）、營養(yǎng)和遺傳等因素（Bolla & Holmefjord, 1988;Haddy & Pankhurst, 2000）。由于魚卵孵化效果直接影響仔稚魚畸形率, 且魚卵人工孵化需花費大量人力物力, 因此, 客觀評價魚卵質(zhì)量并淘汰低質(zhì)量魚卵在水產(chǎn)苗種生產(chǎn)實踐中十分重要。魚類胚胎發(fā)育可用于衡量親魚培育效果及評價仔稚魚質(zhì)量, 且能為其他野生近緣種魚類的快速人工擴繁提供技術(shù)參考。

軟鰭新光唇魚（Neolissochilus benasi）, 隸屬鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）新光唇魚屬（Neolissochilus）。歷史上, 軟鰭新光唇魚是元江流域漁民的主要捕獲對象, 主要分布于云南的河口、江城、西疇及元江等地, 境外分布于越南（Chu & Chen,1989）。近年, 由于捕撈強度大、梯級電站開發(fā)和保護意識薄弱等原因（Yang et al, 2010）, 軟鰭新光唇魚種群衰退嚴重, 其種群在李仙江流域已屬偶見, 目前,僅在云南文山州西疇縣保存有較大種群（Yang et al,2011）。有關(guān)軟鰭新光唇魚的研究主要集中在其分類地位（Chen & Yang, 2003）和精子超低溫冷凍（Wang et al, 2012）, 在人工繁殖、胚胎發(fā)育和仔魚畸形等方面尚未有提及。本研究在軟鰭新光唇魚人工繁殖成功的基礎上, 觀察和描述其胚胎發(fā)育過程, 為后續(xù)器官系統(tǒng)發(fā)生和毒理學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 親魚來源與日常管理

2007年3月—5月, 由云南省江城縣曲水鎮(zhèn)引種軟鰭新光唇魚126尾, 飼養(yǎng)于中國科學院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地（海拔：2 008 m;N25°02′37.2″, E102°55′24.3″）。2008 年 3 月—2009年12月, 由云南省江城縣曲水鎮(zhèn)再次引種軟鰭新光唇魚495尾, 飼養(yǎng)于江城縣附近魚池（海拔1 134 m,N22°35′18.6″, E101°50′57.9″）, 并于 2010 年 5 月運回中國科學院昆明動物研究所珍稀魚類保育研究基地, 共存活459尾。2008年12月—2009年5月,由云南省西疇縣雞街鎮(zhèn)引種軟鰭新光唇魚2 126尾,飼養(yǎng)于西疇縣珍稀魚類養(yǎng)殖基地（海拔 1 091 m,N23°29′21.9″, E104°40′28.3″）。

養(yǎng)殖池塘面積為100～200 m2、水深為1.0～1.5 m,水溫為16～25℃, 養(yǎng)殖密度＜3 kg/m3, 雌雄比為1:1.5。每年 10月—翌年 3月光周期為光照:黑暗為 10 h:14 h, 每年 3月—9月光周期為光照:黑暗為 12 h：12 h。每隔3 d注入一次新水, 每次增加池水15～20 cm。仔稚魚孵出后8～25 d餌料為蛋黃漿和蝦漿等, 每日投喂 4次, 具體投喂量為每千尾用蛋黃一個, 鮮蝦50 g研磨成漿全池潑灑。25 d以后投喂輪蟲, 其后, 餌料主要以111鯉種魚飼料和蛋白含量為40%的粉狀飼料為主, 輔以活餌、添加礦物質(zhì)和維生素等, 上、下午各投喂一次, 日糧為親魚體重的～3%, 每次投喂量以在15～30 min內(nèi)吃完為度。繁殖前1個月營造流水環(huán)境, 促進親魚[體長（182.5±28.1）mm, 體重（95.51±20.1）g]性腺成熟。

1.2 人工繁殖

參照鯉（Cyprinus carpio）人工繁殖方法（Horváth et al, 2002）, 0.9%生理鹽水稀釋混合催產(chǎn)素[促黃體素釋放激素 A2（LHRH-A2, 寧波第二激素廠）2.0 μg/kg及馬來酸地歐酮（DOM, 寧波第二激素廠）1.0 mg/kg], 肌肉注射, 雄魚注射劑量減半。注射～24 h施行干法人工授精, 然后, 魚卵及時用霉菌凈（重慶富爾家動物藥業(yè)有限公司）消毒15 min,孵化水溫控制在 20 ℃。人工授精前, 光學解剖鏡（Zeiss Stemi 2000-C, Germany）/顯微鏡（Olympus CX21）下觀察卵子/精子情況。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

解剖鏡下, 精卵結(jié)合—原腸胚早期, 每 15 min觀察一次; 原腸胚早期—8體節(jié)期, 每30 min觀察一次; 8體節(jié)期—27體節(jié)期, 每1 h觀察一次; 27體節(jié)期—魚苗孵化, 每2 h觀察一次; 魚苗孵化后, 每12 h觀察一次（Zhang & Zhao, 2000; Xing et al,2011）。每次觀察取樣 15粒, 發(fā)育時間以＞50%受精卵到達該期的時間為準。同時, 數(shù)碼相機（Nikon Coolpix 955, Japan）拍攝發(fā)育時相, 胚胎發(fā)育時相及名稱依據(jù)Ma et al（2008）。

1.4 數(shù)據(jù)收集

核偏位率（nucleus deviation rate, ND）為魚卵放置于 10%醋酸溶液后, 發(fā)生核偏離的魚卵數(shù)量占所測魚卵總數(shù)的百分比（Pan et al, 2011）。胚胎存活率（rate of embryo survival）為胚胎發(fā)育到某一發(fā)育時相時存活的胚胎數(shù)量與所觀察胚胎總量的比值。孵化率（hatching success）為出膜仔魚數(shù)量與受精卵總量的比值。生存率（survival success）為仔魚出膜時的存活率, 即出膜仔魚數(shù)量與魚卵總量的比值（Yin,1995）。胚胎畸形率（rate of embryonic malformations）為魚卵從受精到出膜間所產(chǎn)生的畸形胚胎數(shù)量與受精卵總量的比值, 另外, 詳細記錄畸形存在部位（如口、脊椎、胸腔及眼部等）及其他表現(xiàn)形式（如卵黃囊吸收異常及雙頭等）, 統(tǒng)計其數(shù)量并計算其占畸形胚胎總量的百分比。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以mean±SD表示, 單因素方差分析和回歸分析處理數(shù)據(jù), 所有數(shù)據(jù)處理在SigmaPlot10.0中進行, 顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 卵子和精子特性

軟鰭新光唇魚產(chǎn)卵量為 1 986～5 854 粒/尾,卵徑為 2.2～2.8 mm, 卵膜透明, 卵黃球較大, 呈橙黃色。受精卵遇水卵膜逐漸膨脹, 卵徑可達2.5～3.2 mm, 為半浮性卵, 無粘性, 卵粒比重大于水,在靜水中沉底發(fā)育, 但在流水中可以漂浮不沉底。

軟鰭新光唇魚精子密度為（16.32±2.89）×109個/mL, 鮮精平均活力為（60.6±3.2）%, 平均壽命為（70.2±5.3）s。正常情況下, 精液為乳白色, 精子密度越大, 乳白色愈濃, 密度越小, 顏色越淡。

2.2 人工繁殖情況

共催產(chǎn)60尾雌魚和100尾雄魚, 其中, 雌魚成功47尾（78.3%）, 雄魚成功92尾（92.0%）。平均核偏位率為73.2%, 平均孵化率為32.4%, 共孵化仔魚4.35萬尾。各批次的催產(chǎn)、產(chǎn)卵及各時期胚胎存活率見表1。

表1 2009—2011年軟鰭新光唇魚人工繁殖結(jié)果Table 1 Artificial propagation of Neolissochilus benasi from 2009 to 2011

2.3 胚胎發(fā)育

水溫 20 ℃條件下, 軟鰭新光唇魚魚卵從受精到魚苗孵出需～120 h（表2）, 胚胎發(fā)育過程分為受精卵時期、分裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期和孵化期等6個時期。

2.3.1 受精卵期

受精后～30 min, 原生質(zhì)向動物極集中, 動物極頂端顏色逐漸變淺, 在卵黃上方形成明顯突起, 即胚盤, 胚盤不透明, 占胚胎的很小比例 （圖1A）。

2.3.2 分裂期

軟鰭新光唇魚卵子的卵裂屬盤狀卵裂或不完全卵裂, 僅在胚盤上進行。受精后1 h, 胚盤出現(xiàn)第1次分裂, 為經(jīng)裂, 在胚盤頂部中央出現(xiàn)一縱溝,把胚盤分裂成兩個均等的細胞（圖 1B）; 受精后90 min, 進行第2次分裂, 新分裂溝與第1次分裂溝垂直, 為縱裂, 形成四個大小、形態(tài)相似的細胞（圖1C）; 受精后2 h, 進行第3次分裂, 在第1次分裂面的兩側(cè)各出現(xiàn)一條與之平行、而與第 2次分裂溝相垂直的分裂溝, 最后形成8個等大的細胞, 規(guī)則而對稱地排成兩排（圖1D）; 受精后2 h 30 min, 發(fā)生第4次分裂, 在平行于第2次分裂面的兩側(cè)各出現(xiàn)一條分裂溝, 形成4排、每排4個, 共16個細胞, 原生質(zhì)網(wǎng)密集（圖1E）; 受精后3 h, 開始第5次分裂,這次分裂完成后形成4排、每排八個, 共32個細胞,細胞出現(xiàn)差異, 邊緣細胞略大, 分裂球最大寬度和卵黃直徑比較接近; 受精后3 h 30 min, 發(fā)生第6次分裂,形成64個細胞（圖1F）, 從此, 分裂球越分越小, 細胞數(shù)量越來越多, 細胞團呈方形隆起。

2.3.3 囊胚期

卵裂繼續(xù)進行, 細胞愈分愈小, 數(shù)目不斷增加,受精后4 h, 形成128個細胞; 受精后4 h 50 min, 形成256個細胞（圖1H）; 受精后5 h 40 min, 形成512個細胞, 此時, 分裂失去同步性, 中央囊胚外移;受精后6 h 30 min, 卵黃合胞體層形成（圖1I）; 受精后7 h 20 min, 胚盤處細胞團高高隆起, 呈高帽狀,進入囊胚早期（圖1J）; 受精后8 h 10 min, 進入囊胚中期, 胚細胞團高度有所下降; 受精后9 h, 囊胚晚期開始, 胚細胞團進一步下降, 囊胚變低變薄。整個囊胚期持續(xù)時間為～7 h 5 min。

2.3.4 原腸胚期

受精后12 h 5 min, 進入原腸早期（圖1K）, 囊胚細胞繼續(xù)下包, 且由于分裂球的下包、內(nèi)卷運動而在胚盤邊緣形成胚環(huán)（圖1L）; 受精后12 h 35 min, 進入原腸中期, 卵黃 50%被胚盤外包, 可見胚盾雛形;受精后15 h 15 min, 分裂球細胞下包達卵黃體的3/4,胚盾繼續(xù)延伸, 進入原腸末期（圖1M）; 受精后19 h,背緣前端加厚膨大成為腦泡原基, 背唇、腹唇明顯（圖1N）。整個原腸期持續(xù)時間為～6 h 55 min。

2.3.5 體節(jié)期

圖1 軟鰭新光唇魚胚胎發(fā)育（水溫20 ℃）Figure 1 Embryonic development of Neolissochilus benasi at 20 ℃

受精后19 h 30 min, 胚胎發(fā)育進入體節(jié)期, 胚盾逐漸增厚（圖1O）, 形成神經(jīng)板雛形, 胚盤繼續(xù)下包＞5/6的卵黃, 形成卵黃栓（圖 1P）。受精后 21 h 15 min, 胚孔封閉（圖1Q）; 受精后21 h 30 min, 胚體中部出現(xiàn)五對肌節(jié)（圖1R）; 受精后22 h 30 min,胚體中部出現(xiàn)六對肌節(jié), 胚體頭部兩側(cè)形成橢圓形眼囊（圖1S）; 受精后27 h 30 min, 16體節(jié)構(gòu)成的身體呈肩章形（圖1T）; 受精后29 h, 胚體開始出現(xiàn)肌肉效應, 此時肌肉收縮微弱且無規(guī)則節(jié)律（圖1U）。胚體尾部隨時間推移而不斷伸長（圖1V）,心臟位于頭下后方, 受精后42 h, 心臟開始搏動, 初時搏動微弱無力, 逐漸變得強而有力（圖1W）。

2.3.6 孵化期

受精后120 h, 仔魚開始孵出, 孵出前胚體在卵膜內(nèi)環(huán)繞超過一圈, 出膜前胚體扭動加劇, 尾部加速擺動, 最終將卵膜頂破, 胚體脫膜而出（圖1X）。初孵仔魚身體稍彎曲, 數(shù)分鐘后伸直（圖2）。

軟鰭新光唇魚初孵仔魚全長～6.5 mm, 出膜后5～10 h, 仔魚全身透明, 眼睛尚無色素, 血液呈淡黃色, 尾部逐漸伸直, 但卵黃囊大, 游泳能力弱,一般靜臥水底, 做垂直游動（圖3）。

圖2 軟鰭新光唇魚初孵仔魚Figure 2 Newly hatched larvae of Neolissochilus benasi

圖3 軟鰭新光唇魚仔魚（出膜后5～10 h）Figure 3 Larvae of Neolissochilus benasi, 5 to 10 hours after hatching

2.4 仔魚畸形

胚胎發(fā)育過程中, 畸形出現(xiàn)的部位主要有口部、胸腔、脊索及眼部等, 另外, 卵黃蘘吸收異常和雙頭也是畸形的表現(xiàn)形式（圖 4）。其中, 脊索畸形較為常見（92.3%）, 其次分別為胸腔增大（78.1%）、口部畸形（35.4%）、眼部畸形（18.5%）及雙頭（0.1%）。脊索畸形主要出現(xiàn)在體節(jié)期, 胚體并沒有像正常胚胎發(fā)育一樣伸長, 卵黃囊的形狀不能與胚胎的伸直相適應而始終維持橢圓形結(jié)構(gòu),出膜后才繼續(xù)完成胚胎拉長和尾部發(fā)育, 造成胚胎脊索彎曲畸形。脊索畸形均伴隨著胸腔增大, 在胚胎出現(xiàn)肌肉效應后, 胚體肌細胞的收縮和舒張一般為無規(guī)律顫抖, 而后并不形成心臟原基, 無心臟搏動。

2.5 仔魚生長

剛出膜的軟鰭新光唇魚仔魚全長、脊索長和口—肛門長分別為（6.51±0.12）mm、（6.37±0.10）mm和（5.26±0.09）mm（表2）, 混合營養(yǎng)期為5～7 d。出膜后第10 d, 魚苗的卵黃囊全部吸收完, 仔魚開始開口攝食, 能夠自由游動。經(jīng)過15 d的生長, 仔魚全長、脊索長和口—肛門長分別為（13.35±0.44）mm、（12.71±0.39）mm 和（9.79±0.41）mm。45 日齡仔魚平均存活率為86.5%。孵化后40～55 d, 仔魚開始出現(xiàn)鱗片, 進入稚魚期。

3 分析與討論

3.1 親魚培育與魚卵質(zhì)量的關(guān)系

圖4 軟鰭新光唇魚仔魚的畸形形式Figure 4 Deformity models in larvae of Neolissochilus benasiA：脊椎畸形; B：卵黃囊異常; C：雙頭; D：胸腔增大。A：deformities of spinal column; B：yolk-sac resorption abnormalities; C：occurrence of conjoined twins; D：chest deformities.

表2 軟鰭新光唇魚各發(fā)育階段（水溫20 ℃）Table 2 Development stages of Neolissochilus benasi at 20 ℃

親魚培育技術(shù)是在了解培育親魚性腺發(fā)育特點、繁殖習性和影響產(chǎn)卵繁殖的生態(tài)環(huán)境因素的基礎上建立的。但是, 目前尚無法完全模仿多種魚類的繁殖季節(jié)生態(tài)環(huán)境。為確保軟鰭新光唇魚繁殖成功, 除池塘環(huán)境、水質(zhì)、空間和溫度等因素外, 養(yǎng)殖環(huán)境下魚卵質(zhì)量的影響因子更能引起人們的廣泛關(guān)注（Pan et al, 2009）, 但雄魚精液品質(zhì)檢測則鮮見報道（Wang et al, 2012）。軟鰭新光唇魚精液監(jiān)測發(fā)現(xiàn), 雄性個體鮮精平均活力為（60.62±3.21）%, 低于鯉（Cyprinus carpio）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）和草魚（Ctenopharyngodon idellus）等（Chen et al, 1992）。但是, 若使用鮮精實施人工授精, 原腸胚早期胚胎存活率均＞50%,因此, 鮮精活力并不一定會影響魚卵受精率。由于繁殖所用魚類均采自野外, 雖然經(jīng)過短暫池塘飼養(yǎng),初步建立親魚培育技術(shù)體系, 但仍然有許多技術(shù)細節(jié)需要完善。在滇池金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）和撫仙金線鲃（Sinocyclocheilus tingi）親魚培育實踐中也發(fā)現(xiàn)了類似問題, 而盡量提供適合的養(yǎng)殖條件, 最大限度低捕獲誘發(fā)的壓力, 可以顯

表3 軟鰭新光唇魚孵化期和胚后發(fā)育各階段仔魚測量Table 3 Average measurements (mm) of hatchlings and post-larvae of Neolissochilus benasi at various stages of development

著提高繁殖效率（Pan et al, 2009, 2011）。

3.2 胚胎發(fā)育特點

本研究首次描述軟鰭新光唇魚的胚胎發(fā)育, 其胚胎發(fā)育過程與寬口光唇魚（Acrossocheilus monticola）（Yan et al, 1999）、云南光唇魚（Acrossocheilus yunnanensis）（Tang & He, 1982）、 倒 刺 鲃（Spinibarbus denticulatus denticulatus）（Yi et al,2004）、中華倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）（Huang et al, 2009）、黑脊倒刺鲃（Spinibarbus caldwelli）（Huang, 2009）、斑馬魚（Danio rerio）（Kimmel et al,1995）和鱇魚良白魚（Anabarilius grahami）等（Ma et al, 2008）較為相似, 主要形態(tài)特征出現(xiàn)順序基本相同, 僅分期時間略有不同。相對于同屬鲃亞科的倒刺鲃（44 h）、寬口光唇魚（～57 h）、黑脊倒刺鲃（～60 h）、中華倒刺鲃（～60 h）和云南光唇魚（66 h）, 軟鰭新光唇魚發(fā)育速度較慢, 這可能與其較大的卵黃囊（Tang & He, 1982; Yan et al, 1999）和較低的孵化溫度有關(guān)（Yan et al, 1999）, 與寬口光唇魚、云南光唇魚、倒刺鲃和斑馬魚相比, 原腸胚末期, 軟鰭新光唇魚胚體中部已可見體節(jié)雛形。

3.3 胚胎與仔魚致畸原因分析

自然狀況下, 魚類胚胎和仔魚階段畸形＜10%（Klumpp & Von Westernhagen, 1995）。西疇人工孵化畸形率較接近自然狀況（2.4%～8.7%）, 而昆明的畸形率則較高（＞30%）。一般認為, 胚胎與仔魚畸形與自然環(huán)境中水的溫度、硬度、pH、光周期以及食物組成和營養(yǎng)等密切相關(guān)（Bolla & Holmefjord,1988; Haddy & Pankhurst, 2000）。昆明和西疇兩地親魚的培育方案相同, 但昆明種群培育效果優(yōu)于西疇種群, 初步認為昆明種群的胚胎和仔魚畸形率偏高與水（溫度等）和光周期等自然因素關(guān)系更大, 且這些因素的協(xié)同作用可能導致了魚卵早破現(xiàn)象。

魚卵早破是指胚胎發(fā)育至原腸胚末期后, 卵膜出現(xiàn)皺襞或塌癟, 在流水沖擊下胚胎提前出膜,進而導致胚胎畸形的現(xiàn)象, 其原因主要有：魚卵質(zhì)量差、孵化用水溶氧低及放卵密度過大等。卵子過熟或不成熟均為魚卵質(zhì)量差的表現(xiàn), 可體現(xiàn)于卵徑大小、卵子形態(tài)等外部形態(tài)。孵化用水溶氧低可能是由于受精率低, 死卵較多, 不能及時將死卵移出孵化盆而引起水質(zhì)惡化導致缺氧。放卵密度過大, 水中溶解氧不能滿足胚胎發(fā)育所需溶氧也會導致胚胎畸形。軟鰭新光唇魚發(fā)育至原腸胚期時, 由于魚卵質(zhì)量較差、水溫波動較大及水質(zhì)惡化等原因, 使細胞分裂時序紊亂, 但在該時期很難觀察到畸形產(chǎn)生?；沃饕霈F(xiàn)在體節(jié)期, 胚體沒有伸長, 尾芽發(fā)育停滯, 出膜后尾部才繼續(xù)發(fā)育, 造成胚體脊索不能正常向前后伸直,或是弓背, 或是彎尾, 或是兩者兼有, 從而使神經(jīng)管、腦、脊髓及眼睛不能正常分化。因此, 在親魚培育管理中應盡量提供適合的養(yǎng)殖條件, 如池塘大小、水質(zhì)和光強度等。

另外, 高活性新型魚類催產(chǎn)劑的使用使得許多生殖功能紊亂魚類在池塘養(yǎng)殖環(huán)境下得以繁衍。與傳統(tǒng)催產(chǎn)劑（魚腦垂體勻漿液和人體絨毛膜促性腺激素）相比, 高活性新型魚類催產(chǎn)劑催產(chǎn)效果好且穩(wěn)定、成本低、效價穩(wěn)定且排卵和產(chǎn)卵效應時間短而具規(guī)律性, 有利于安排生產(chǎn)。但也有研究表明,使用催產(chǎn)劑效果不顯著, 而對魚卵質(zhì)量影響很大（Bonnet et al, 2007）, 如對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的人工催產(chǎn)研究顯示, 催產(chǎn)劑的使用是造成眼色素出現(xiàn)后的胚胎和出膜后仔魚大量死亡的原因之一（Bonnet et al, 2007）

3.4 人工增殖實踐中的問題

目前, 魚類早期胚胎畸形率高的機制尚不明確。多數(shù)研究認為偏高或偏低的溫度是導致胚胎和仔魚大量畸形的主要原因之一（Huang et al, 2009）,而在人工控制條件下, 例如控制溫度、溶氧等, 并未降低胚胎畸形率, 有時反而增高。在孵化過程中,除魚卵質(zhì)量外, 某些物理因素也可導致胚胎死亡,例如孵化用水溶氧過高, 在魚卵周圍集聚一個或數(shù)個氣泡, 使魚卵長時間不能下沉, 導致魚卵死亡。這種情況主要發(fā)生在孵化后期, 此時水質(zhì)變肥, 水溫高時光合作用強, 水中溶解氧過飽和, 而及時加入新水則可解決該問題。

致謝：中國科學院昆明動物研究所的馬莉協(xié)助處理胚胎發(fā)育照片; 中國科學院昆明動物研究所的楊劍、劉淑偉、楊博、王偉營和蔣萬勝參加了部分野外引種工作, 西疇縣第一中學的徐紅梅和西疇縣新街鎮(zhèn)的徐清輝參加了西疇縣珍稀魚類養(yǎng)殖基地的親魚培育和人工繁殖工作, 在此一并表示感謝！