狗牙根與牛鞭草在三峽庫區(qū)消落帶水淹結(jié)束后的抗氧化酶活力

李兆佳，熊高明，鄧龍強(qiáng)，謝宗強(qiáng)，樊大勇，*

(1.中國科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國家重點實驗室，北京 100093;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049;3.湖北神農(nóng)架國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，湖北神農(nóng)架 442400)

三峽水庫運(yùn)行后，在庫區(qū)沿岸海拔145—175 m之間形成落差高達(dá)30 m的消落帶，原來的陸生生態(tài)系統(tǒng)演變?yōu)榧竟?jié)性濕地生態(tài)系統(tǒng)。生長環(huán)境的巨大變化和反季節(jié)水淹的頻繁干擾導(dǎo)致原有的大部分植物種類因不適應(yīng)而逐漸消亡［1］。三峽水庫消落帶將面臨生物多樣性減少，污染加劇，生態(tài)系統(tǒng)更為脆弱等問題［2］。因此，三峽水庫消落帶植被的生態(tài)治理對維持三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定具有十分重要的意義［3］。

對三峽水庫消落帶植被的生態(tài)治理首先需要研究的問題就是消落帶適宜植物的水淹耐受機(jī)理。對水淹脅迫耐受能力的強(qiáng)弱直接決定了植物是否適宜在消落帶環(huán)境生長。淹沒條件下，植物通過增加通氣組織、伸長生長、調(diào)節(jié)葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)等方式增強(qiáng)水下氣體交換和水下光合［4］?？寺≈参锾赜械目寺≌蠙C(jī)制并有助于整個克隆片段抵御水淹脅迫［5］。此外，水淹前的碳水化合物儲存能力［6］、水淹過程中對碳水化合物的分配［7-8］以及水淹過后積極恢復(fù)的能力［9］被認(rèn)為是構(gòu)成植物水淹耐受能力的重要組分。

水淹結(jié)束后積極恢復(fù)的能力有利于消落帶的多年生植物占據(jù)空間生態(tài)位，在出露周期內(nèi)迅速恢復(fù)生長很可能使植株在水淹周期前儲存更多碳水化合物。多年野外調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三峽庫區(qū)消落帶形成后狗牙根和牛鞭草是適合當(dāng)?shù)厣车亩嗄晟荼局参铮?，10］。長期模擬水淹研究結(jié)果表明狗牙根和牛鞭草能夠在水淹結(jié)束后迅速恢復(fù)生長［11］。6個月水淹處理后狗牙根在15 d以內(nèi)開始恢復(fù)生長，且蓋度迅速增加［12］。Luo等［13］經(jīng)過30 d模擬水淹處理顯示，牛鞭草在水淹結(jié)束后10—20 d就開始恢復(fù)生長，且光合生理恢復(fù)領(lǐng)先于生長恢復(fù)。然而，目前是何種生理生態(tài)過程決定了恢復(fù)過程的快慢仍需要進(jìn)一步的研究。

長期水淹脅迫導(dǎo)致無氧呼吸替代有氧呼吸、細(xì)胞內(nèi)還原勢增加等一系列細(xì)胞生理狀態(tài)變化［14］。消落帶適宜物種要重新適應(yīng)水淹結(jié)束后正常的生長條件，其中一個問題是水淹過后植物與空氣的重新接觸可能會導(dǎo)致其受到的氧化脅迫程度明顯增高［15］，即使植物可以忍耐長期的水淹脅迫，但在恢復(fù)期內(nèi)卻可能因為不耐受高水平氧化脅迫而死亡［16］，這可能是河岸帶和消落帶植物分布的重要限制因子［17］。大量研究表明植物體內(nèi)抵御氧化脅迫的體系非常完備，其中超氧化歧化酶(SOD，EC 1.15.1.1)、抗壞血酸過氧化物酶(APX，EC 1.11.1.11)、過氧化氫酶(CAT，EC1.11.1.6)是清除活性氧(ROS)、降低氧化脅迫的關(guān)鍵酶［18-19］。因此，水淹后的恢復(fù)階段，狗牙根和牛鞭草的恢復(fù)動態(tài)是否會與其體內(nèi)清除ROS的SOD、APX、CAT的活性動態(tài)相關(guān)?

目前，有關(guān)三峽消落帶適宜植物的水淹耐受機(jī)理的研究大部分采用模擬水淹方式［11，13，20］。由于模擬水淹實驗不能完全對應(yīng)自然狀況(自然狀況下水壓、水深、光照等條件與模擬淹水實驗條件差別很大)，采用野外采樣、對比測定的手段，研究了三峽庫區(qū)消落帶生長的狗牙根和牛鞭草的根系在水淹后恢復(fù)過程中清除ROS的關(guān)鍵酶的活性動態(tài)，以期回答上述科學(xué)問題，并為消落帶人工植被恢復(fù)重建提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗地點

實驗地位于重慶市忠縣石寶鎮(zhèn)共和村三峽水庫消落帶(30°24′22″N，108°24′26″E)。屬暖濕亞熱帶山地氣候，溫?zé)岷疀?，四季分明，雨量充沛，日照充足?/p>

1.2 實驗材料

狗牙根，Cynodon dactylon(L.)Pars，禾本科多年生草本植物，具根狀莖或匍匐莖，匍匐莖節(jié)上生根及分枝;對Cu、Cd、Sb等重金屬具有較強(qiáng)富集能力①陶星星，兩個典型礦區(qū)植物積累重金屬調(diào)查與研究(碩士論文).2008，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué).，可作為牧草或草坪草;在國內(nèi)分布于華南、黃河流域及以南地區(qū)、長江流域及以南地區(qū)和新疆等地。

牛鞭草，Hemarthria altissima，禾本科多年生草本，有長而橫走的根莖。牛鞭草在我國分布較廣，東北、華北、華中、華南、西南各地皆有存在，多生于田地、水溝、河灘等濕潤處，常用作牧草。

兩者均具有克隆習(xí)性，能較快擴(kuò)張占領(lǐng)生境，在長江中上游地區(qū)牛鞭草常與狗牙根等相伴而生［21］。

1.3 實驗設(shè)計

2008年3—6月劃定5 m×30 m樣地4塊，其中2塊位于海拔158 m，作為水淹及恢復(fù)處理組;另外2塊樣地位于海拔175 m，作為對照組。每個海拔的樣地按照20 cm×30 cm株行距分別移栽當(dāng)?shù)胤N源的狗牙根和牛鞭草，移栽后只作簡單的除雜草維護(hù)。

2009年春三峽水庫水位下降，158 m樣地出露前一天(第0天)進(jìn)行第1次取樣，此后每8d②本研究取樣間隔根據(jù)參考文獻(xiàn)以及實地觀察結(jié)果確定:檢測水淹(或缺氧)條件下抗氧化酶活力的取樣間隔根據(jù)處理時間長短從數(shù)十分鐘到數(shù)天不等;水淹處理長達(dá)數(shù)個月的文獻(xiàn)報道表明植株在水淹結(jié)束后3—10d內(nèi)開始恢復(fù)生長;據(jù)實地觀察，三峽庫區(qū)消落帶冬季水淹結(jié)束后，植株在1周內(nèi)基本開始復(fù)蘇，在1個月內(nèi)生長至正常水平取樣一次:分別在4塊樣地上各挖取植株，每塊樣地取4棵作為重復(fù)，迅速洗凈根系，吸干水分后稱取0.5—1.0 g(鮮重)根部組織放入液氮中保存，用于檢測SOD、APX、CAT酶活力。為盡力保證植物樣品一致性，減少因日間光照、溫度、水分的日變化引起的生理狀態(tài)差異，每次取樣均在清晨5:00—8:00之間進(jìn)行。

根據(jù)長江水文網(wǎng)(http://www.cjh.com.cn)的三峽水庫忠縣水位記錄，實驗期間海拔175 m樣地水淹共0 d，海拔158 m樣地水淹共195 d。

1.4 根系取樣與粗酶提取

取樣時，把植株完整挖出，輕柔洗凈根上的土，并用蒸餾水沖洗3遍。稱取根系0.5—1 g，立即置于液氮中急凍，并于-70℃下保存，用于酶活力檢測。酶提取與活力檢測方法在Jiang和Zhang［22］基礎(chǔ)上作修改［23］:在預(yù)冷的研缽中放入剪碎的根系樣本，加入液氮，將樣本研磨至粉末，加入適量粗酶提取液，勻漿液4℃下以15000 g離心20 min，上清液為粗酶液。

1.5 SOD(EC 1.15.1.1)活力檢測

在盛有3 mL SOD反應(yīng)混合液(預(yù)熱至25℃)的試管中，加入100 μL粗酶液。終濃度分別為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.8)，13 mmol/L甲硫氨酸，75 μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)，2 μmol/L 核黃素，0.1 mmol/L EDTA-Na2。混合后放在單排透明試管架上，在光照培養(yǎng)箱(25℃，12000lx)內(nèi)照光10 min，迅速測定OD560。以加粗酶液但不照光的反應(yīng)液為空白、蒸餾水代替粗酶液的照光管做對照。以抑制反應(yīng)50%的酶量為一個SOD酶活力單位。

1.6 APX(EC 1.11.1.11)活力檢測

2.5 mL APX反應(yīng)混合液(預(yù)熱至20℃)中依次加入100 μL粗酶液、0.4 mL H2O2稀釋液(預(yù)熱至20℃)。終濃度分別為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.0)，0.1 mmol/L EDTA-Na2，0.03 mmol/L AsA(抗壞血酸，ascorbate)，0.06 mmol/L H2O2。加入H2O2后立即測定0—5 min內(nèi)的OD290值變化，每30 s記錄1次讀數(shù)，計算單位時間內(nèi)AsA減少量(AsA比吸光系數(shù)2.8 mmol·L-1·cm-1)并計算酶活性(1個酶活定義為1U=1μmol AsA/s減少量)。蒸餾水作空白，對照用蒸餾水代替酶液。

1.7 CAT(EC 1.11.1.6)活力檢測

2.8 mL反應(yīng)液(預(yù)熱至20℃)中加入200 μL粗酶液，終濃度分別為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.0)，10 mmol/L H2O2?；旌虾罅⒓礈y定0—2 min內(nèi)的OD240值變化，每30 s記錄1次讀數(shù)，計算單位時間內(nèi)H2O2減少量(H2O2比吸光系數(shù)39.4 mmol·L-1·cm-1)及酶活性(1個酶活定義為1U=1 μmol H2O2/s減少量)。蒸餾水作空白，對照用蒸餾水代替酶液。

1.8 統(tǒng)計分析方法

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用SPSS 16.0，采用t檢驗分析海拔175 m與158 m之間對應(yīng)指標(biāo)的差異顯著性;用二元相關(guān)分析方法確定指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系。用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果

長期水淹脅迫(圖1，海拔158 m，第0天)條件下，狗牙根和牛鞭草根部SOD、APX酶活力均高于對照(圖1，海拔175 m，第0天)且大部分呈顯著差異，與此相反，處理組CAT均顯著低于對照。

水淹結(jié)束后(圖1，第8天，第16天)，SOD、APX酶活性均維持或上升到較高水平。狗牙根CAT稍低于對照而牛鞭草CAT上升幅度較大，但差異不顯著。

酶活力的變化反映了物種間的差異。牛鞭草SOD、APX、CAT酶活力相對值(處理/對照)均在8—16 d達(dá)最高，分別為對照的3.9倍、9.3倍、3.6倍，而狗牙根3個酶活力的變化逐漸趨向于對照值(圖1)。

盡管起始特征、恢復(fù)期變化動態(tài)各有特點，但恢復(fù)階段后期(第24天)兩個物種所有酶活力均與對照水平相近，沒有顯著差異。

相關(guān)分析表明，實驗觀察過程中3個酶活力兩兩正相關(guān)。這種相關(guān)性在很大程度上與受脅迫然后逐漸恢復(fù)的植株有關(guān)，因為若按照海拔劃分?jǐn)?shù)據(jù)，相關(guān)顯著性完全集中于158 m處理組;不同物種之間則以牛鞭草根系各酶活力之間的相關(guān)性為主，狗牙根根系只有SOD-APX之間顯著相關(guān)(圖2)。

表1 基于檢測個體數(shù)據(jù)的SOD、APX、CAT酶活力Pearson相關(guān)系數(shù)及p值Table 1 Pearson correlation coefficient and p value of correlation analysis among antioxidant enzyme activities based on plant individuals

3 討論

3.1 長期水淹脅迫導(dǎo)致SOD、APX酶活力增強(qiáng)而CAT酶活力降低

長期水淹脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過度積累:細(xì)胞缺氧引起的高還原勢條件下NAD(P)H/NAD(P)+循環(huán)受阻、線粒體電子傳遞鏈飽和，電子在傳遞過程中泄漏并還原氧分子［14，24］。植物體可以通過提高ROS清除酶的活力以清除過度積累的ROS，降低氧化脅迫程度［25］。長期水淹脅迫后(圖1，第0天)狗牙根、牛鞭草的根部SOD、APX活力普遍顯著高于對照。這與一些研究報道相近:復(fù)氧階段羽扇豆(Lupinus luteus L.，cv.Juno)根系SOD、CAT活力上升，但POD只受到輕微影響［26］;黃菖蒲(Iris pseudacorus L.)與德國鳶尾(Iris germanica L.)在缺氧處理和恢復(fù)階段的SOD酶活性均高于對照，且耐受性越高其增加幅度越大［27］;缺氧增加了小麥根系SOD在非變性凝膠電泳中的條帶數(shù)量，導(dǎo)致SOD總活力上升并持續(xù)至復(fù)氧階段［28］。而狗牙根與牛鞭草的根部CAT起始活力均低于對照(圖1)，這可能是受到對CAT活力的抑制作用影響。這種作用在體外實驗中得到證實，因而CAT在體內(nèi)條件下很可能也受影響［29］。

3.2 水淹結(jié)束后恢復(fù)期間清除ROS的關(guān)鍵酶活性發(fā)生了動態(tài)變化

圖1 狗牙根與牛鞭草根系SOD、APX和CAT酶活力動態(tài)Fig.1 Activity dynamics of SOD，APX and CAT from roots of C.dactylon and H.altissima

Unger等［30］對土壤化學(xué)特性的研究顯示，水淹結(jié)束后土壤孔隙的O2濃度與水淹期間相比存在顯著躍升。植物體與空氣重新接觸，水淹脅迫導(dǎo)致的處于過還原狀態(tài)的根際和細(xì)胞環(huán)境將O2還原為［31］，這將會誘導(dǎo)或者加重(水淹脅迫引起的)氧化脅迫［32］，并誘導(dǎo)清除ROS的關(guān)鍵酶的活性上升［33］。研究結(jié)果表明:相對于對照，這兩個物種在恢復(fù)階段的SOD和APX均保持了較高水平(圖1，第8天，第16天)，說明恢復(fù)階段確實出現(xiàn)了較高水平的氧化脅迫。

水淹結(jié)束一段時間后，植物根部受脅迫誘導(dǎo)的無氧呼吸途徑關(guān)鍵酶活力下降［34］。可以認(rèn)為呼吸代謝逐漸恢復(fù)到正常的有氧代謝模式，O2重新作為電子最終受體，因而植物細(xì)胞內(nèi)ROS生產(chǎn)水平較恢復(fù)起始階段下降，ROS清除酶活力也可能因此隨之下降(圖1，第24天)。結(jié)果表明:狗牙根和牛鞭草根部的酶活力在24 d左右完全回復(fù)至對照水平，可以認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的ROS代謝已經(jīng)趨于穩(wěn)定平衡，植株已基本處于未受氧化脅迫的狀態(tài)。這個結(jié)果與長期模擬水淹實驗的結(jié)果［12-13，20］吻合，說明恢復(fù)期內(nèi)氧化脅迫水平與恢復(fù)生長狀態(tài)緊密相關(guān)。

3.3 恢復(fù)過程中兩個物種酶活力動態(tài)并不一致

圖2 基于植株個體數(shù)據(jù)的SOD、APX和CAT酶活力相關(guān)分析Fig.2 Activity-correlation between SOD，APX and CAT based on plant individuals

本實驗中，狗牙根CAT活力迅速恢復(fù)到對照水平，而牛鞭草CAT活力迅速增至較高水平，只因波動較大而與對照未形成顯著差異(圖1)。這個差別可能源于兩個物種細(xì)胞中ROS調(diào)節(jié)途徑的不同響應(yīng)。在功能上，CAT、AsA-GSH循環(huán)(抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán))以及GPX(谷胱甘肽過氧化物酶)均能催化分解H2O2，在維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)穩(wěn)定方面，三者在一定程度上互為冗余、互相補(bǔ)充［35-37］，因此，可能兩個物種在催化分解H2O2途徑上存在差異。此外，牛鞭草在恢復(fù)過程中3-個酶與對照組的相對活性均有不同程度的增加，而狗牙根3個酶的相對活性基本維持不變。這可能說明牛鞭草在恢復(fù)階段處于更高水平的氧化脅迫下;或其它機(jī)制也參與了對狗牙根的ROS清除過程。

3.4 消落帶位點恢復(fù)過程中3個酶的活性顯著正相關(guān)

海拔158 m位點的植物在恢復(fù)過程中抗氧化酶活力之間出現(xiàn)顯著相關(guān)(圖2)，可能是植物細(xì)胞維持ROS代謝內(nèi)穩(wěn)態(tài)的體現(xiàn)。SOD分布于所有細(xì)胞器內(nèi)，能夠催化超氧陰離子自由基()發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2及O2［18］，而APX和CAT則進(jìn)一步清除H2O2［19］。研究報道顯示，對細(xì)胞有潛在毒性的ROS同時也具有信號傳導(dǎo)作用［38-39］，低濃度下，H2O2作為信號分子參與出發(fā)各種脅迫響應(yīng)［40］，高濃度下則發(fā)出細(xì)胞程序性死亡［41］。因此，恢復(fù)期植物可以通過調(diào)節(jié)酶活力以及加強(qiáng)各關(guān)鍵酶的協(xié)作作用(相關(guān)關(guān)系)［32］，最大能力清除過量積累的ROS，以避免細(xì)胞遭受不可逆轉(zhuǎn)的損傷。而對照組3個抗氧化酶活力之間沒有顯著相關(guān)性，原因可能是非氧化脅迫狀態(tài)下其他代謝途徑與ROS代謝的相互作用加強(qiáng)，ROS代謝過程可能不是制約植物生存生長的唯一關(guān)鍵生理生態(tài)過程。

總之，我們采用野外采樣、對比測定的方法研究了三峽庫區(qū)消落帶生長的狗牙根和牛鞭草的根系在水淹后恢復(fù)過程中的ROS清除的關(guān)鍵酶的活性動態(tài)。發(fā)現(xiàn):長期水淹脅迫導(dǎo)致SOD、APX酶活增強(qiáng)而CAT酶活降低;淹水后恢復(fù)期，清除ROS的關(guān)鍵酶活性發(fā)生了動態(tài)變化，這可能與水淹過后的積極恢復(fù)生長能力有密切關(guān)系;恢復(fù)過程中兩個物種酶活動態(tài)并不一致;恢復(fù)過程中3個酶的活性呈顯著相關(guān)。盡管有關(guān)ROS代謝與恢復(fù)生長之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步的直接證據(jù)，本文的研究結(jié)果有助于揭示消落帶植物適應(yīng)的生理生態(tài)機(jī)制，也為消落帶生態(tài)恢復(fù)治理實踐提供了重要的理論基礎(chǔ)。

致謝:感謝重慶大學(xué)郭勁松教授、夏玉仙教授和曾德玉老師提供檢測設(shè)備支持。

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