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    大黃素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

    2013-12-14 02:40:08魏建波浙江省立同德醫(yī)院杭州310012
    關(guān)鍵詞:凝膠電泳黃素膠原

    魏建波 劉 琴 鐘 瑜 姜 凱 浙江省立同德醫(yī)院 杭州 310012

    腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病慢性進(jìn)展直至發(fā)生終末期腎病的重要因素[1],臨床有應(yīng)用大黃或以大黃為主藥治療腎間質(zhì)纖維化疾病[2-3],并且取得較好療效。筆者觀察大黃提取物大黃素對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化防治的干預(yù)作用,并探討其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng) 物 Wistar雄性大鼠60只,體質(zhì)量(180±20)g,清潔級(jí),浙江省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙2008-0033)。

    1.2 藥物和主要試劑 大黃素,成都茂辰生物科技有限公司生產(chǎn);I型膠原(C-I)、Ⅲ前膠原肽(PⅢP)、透明質(zhì)酸(HA)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海瑞奇生物科技有限公司;Trizol試劑盒,購(gòu)自Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒,購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    1.3 主要儀器 低溫高速離心機(jī)為美國(guó)Beckman Coulter;PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品;凝膠電泳儀為美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品。

    2 方法

    2.1 大鼠造模與給藥 常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1周后,將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、模型組及大黃素小、中、大劑量組各12只。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,進(jìn)行氣管插管。除假手術(shù)組外,其余各組大鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段制備腎間質(zhì)纖維化模型,假手術(shù)對(duì)照組行手術(shù)但不結(jié)扎。次日大黃素各組分別給予大黃素25、50和80mg/kg腹腔注射給藥,1周3次,共4周。假手術(shù)對(duì)照組、模型對(duì)照組用等量生理鹽水代替。

    各組動(dòng)物于造模后28天后,眼球取血后處死。大鼠血離心后,取血清-20℃保存?zhèn)溆?;左?cè)腎臟行原位灌流去除血細(xì)胞后,腎組織液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 觀察指標(biāo) ①各組大鼠生存狀況并記錄生存曲線。②血清 C-I、PⅢP、HA含量檢測(cè):采用ELISA方法檢測(cè)血清中C-I、PⅢP、HA含量。③RT-PCR檢測(cè)大鼠腎組織TGF-βmRNA的表達(dá):采用Trizol一步法示提取組織總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行RT-PCR,mRNA定量采用半定量的RT-PCR法。引物序列如下:TGF-β 上游:5’-gaagtggatccacgagcccaag-3’,下游:5’-gctgcacttgcaggagcgcac-3’,內(nèi)參照GAPDH 上游:5’-tggaatcctgtggcatccatgaaac-3’,下游:5'-acgcagctcagtaacagtccg-3’。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為:94℃,30sec;54℃,40sec;72℃,1min;30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析,以對(duì)GAPDH相對(duì)值記錄結(jié)果。

    2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 生存曲線 記錄各組大鼠實(shí)驗(yàn)開始至第28天的生存狀況。對(duì)照組大鼠第28天時(shí)存活10只,模型組大鼠第28天僅存活4只,大黃素小劑量組、中劑量組、大劑量組大鼠到第28天時(shí)分別存活6只、7只和8只,較模型組有明顯升高。見圖1。

    圖1 各組大鼠生存曲線

    3.2 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清C-I、PⅢP、HA含量顯著升高(P均<0.01);與模型組比較,大黃素各組血清C-I、PⅢP、HA含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),見表1。

    3.3 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)的影響 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。將電泳條帶進(jìn)行凝膠成像比較分析,見圖3,模型組腎組織TGF-βmRNA表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。大黃素各劑量組TGF-βmRNA表達(dá)與模型組比較顯著下降(P<0.05,P<0.01)。

    表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較(±s) μg/L

    表1 各組大鼠血清中C-I、PⅢP、HA含量比較(±s) μg/L

    注:與對(duì)照組比較,△P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    n/只C-I PⅢP HA 組 別

    圖2 腎組織TGF-βmRNA RT-PCR凝膠電泳圖

    圖3 大黃素對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)的影響

    4 討論

    大黃素是從大黃生藥中分離提純的有效成分之一,具有抑菌消炎、抗氧化,以及抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸活動(dòng)、抗肝腎纖維化等多種藥理作用[4-6]。本實(shí)驗(yàn)采用單側(cè)輸尿管梗阻法制備腎間質(zhì)纖維化模型[7]。腎間質(zhì)纖維化是腎間質(zhì)細(xì)胞增生,腎間質(zhì)膠原過度沉積,最終導(dǎo)致纖維化的過程。

    I型膠原(C-I)、Ⅲ前膠原肽(PⅢP)、透明質(zhì)酸(HA)是觀察纖維化過程的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型組相比,大黃素能明顯降低大鼠血清HA、C-I和PⅢP水平,說明大黃素有較好的抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成,促進(jìn)其降解,減輕腎纖維化作用。大黃素給藥組大鼠最終生存數(shù)量明顯多于模型組,提示大黃素可能具有治療腎纖維化的作用。

    轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)是公認(rèn)的促纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子之一,在腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程中起重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎組織TGF-βmRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,經(jīng)大黃素干預(yù)治療后,TGF-β表達(dá)顯著降低,提示降低TGF-β的表達(dá)量可能是大黃素抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制之一。

    [1]EddyAA.Molecularbasisofrenal fibrosis[J].PediatrNephrol,2000,15:290-301.

    [2]劉明,何學(xué)紅,李林,等.大黃在慢性腎功衰竭不同階段的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2006,24(1):45-46.

    [3]周媧,涂為平,楊麗平,等.大黃對(duì)非尿毒癥慢性腎衰竭患者微炎癥狀態(tài)的影響[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2012,52(5):62-66.

    [4]嚴(yán)澤軍,程躍,蔣軍輝,等.大黃素通過非Caspase依賴通路誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞BIU87凋亡的機(jī)制[J].中華泌尿外科雜志,2012,33(4):259-263.

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    [6]BhadaufiaM ,Shrivastava S,Nirala SK,etaL.Emodin reverses CCL4 induced hepatic cytochrome P450(CYP)enzymatic and ultrastructural changes:The in vivo evidence[J]HepatolRes,2009,39(11):290-300.

    [7]張志新,何立群.腎小管間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(4):969-971.

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